Электрораспылительная ионизация в масс-спектрометрии

Введение

Техника, используемая в масс-спектроскопии.

Электрораспылительная ионизация (ЭРИ) – это техника, используемая в масс-спектрометрии для получения ионов посредством электрораспыления, при котором высокое напряжение подается на жидкость для создания аэрозоля. Она особенно полезна для получения ионов из макромолекул, поскольку преодолевает склонность этих молекул к фрагментации при ионизации. ЭРИ отличается от других процессов ионизации (например, матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации, MALDI) тем, что может генерировать многозарядные ионы, эффективно расширяя диапазон масс анализатора для охвата порядков величин kDa и MDa, наблюдаемых у белков и связанных с ними полипептидных фрагментов. Масс-спектрометрия с использованием ЭРИ называется электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрией (ЭРИ-МС) или, реже, электрораспылительной масс-спектрометрией (ЭР-МС). ЭРИ является так называемой «мягкой ионизацией», поскольку фрагментация минимальна. Это может быть преимуществом, поскольку молекулярный ион (или, точнее, псевдомолекулярный ион) почти всегда наблюдается, однако из простого полученного масс-спектра можно получить очень мало структурной информации. Этот недостаток можно преодолеть, объединив ЭРИ с тандемной масс-спектрометрией (ЭРИ-МС/МС). Другим важным преимуществом ЭРИ является возможность сохранения информации о фазе раствора при переходе в газовую фазу. Техника электрораспылительной ионизации была впервые описана Масамичи Ямаситой и Джоном Фенном в 1984 году, а также независимо Лидией Галл и ее коллегами в Советском Союзе, также в 1984 году. Работа Галл не была признана или переведена в западной научной литературе до публикации перевода в 2008 году. В 2002 году присуждение Нобелевской премии по химии Джону Беннету Фенну и Коичи Танаке стало признанием их заслуг. Один из оригинальных приборов, использованных Фенном, экспонируется в Институте истории науки в Филадельфии, штат Пенсильвания.

История

В 1882 году лорд Рэлей теоретически оценил максимальное количество заряда, которое может нести жидкая капля, прежде чем начать выбрасывать тонкие струи жидкости. Это теперь известно как предел Рэлея. В 1914 году Джон Зелени опубликовал работу о поведении капель жидкости на концах стеклянных капилляров и представил доказательства существования различных режимов электрораспыления. Уилсон, Тейлор и Нолан исследовали электрораспыление в 1920-х годах, а Макки – в 1931 году. Электрораспылительный конус (ныне известный как конус Тейлора) был описан сэром Джеффри Инграмом Тейлором. Первое применение электрораспылительной ионизации в сочетании с масс-спектрометрией было продемонстрировано Малкольмом Доулом в 1968 году. Джон Беннетт Фенн был удостоен Нобелевской премии по химии в 2002 году за разработку электрораспылительной масс-спектрометрии в конце 1980-х годов.

Механизм ионизации

Жидкость, содержащая аналиты, представляющие интерес (обычно требуется 10⁶–10⁴ М), диспергируется в виде тонкого аэрозоля с помощью электроспрея. Поскольку образование ионов включает в себя интенсивное испарение растворителя (также называемое десольватацией), типичные растворители для электроспрей-ионизации готовятся путем смешивания воды с летучими органическими соединениями (например, метанолом, ацетонитрилом). Для уменьшения начального размера капель в раствор обычно добавляют соединения, повышающие проводимость (например, уксусную кислоту). Эти соединения также служат источником протонов для облегчения процесса ионизации. Электропряжи с высоким расходом могут извлекать выгоду из небулизации нагретого инертного газа, такого как азот или диоксид углерода, в дополнение к высокой температуре источника ESI. Аэрозоль поступает в первую вакуумную ступень масс-спектрометра через капилляр с разностью потенциалов около 3000 В, который может нагреваться для дальнейшего испарения растворителя из заряженных капель. Растворитель испаряется из заряженной капли до тех пор, пока она не станет нестабильной, достигнув предела Рэлея. В этот момент капля деформируется, поскольку электростатическое отталкивание одноименных зарядов, в постоянно уменьшающемся размере капли, становится сильнее поверхностного натяжения, удерживающего каплю вместе. В этот момент капля подвергается кулоновскому делению, при котором исходная капля "взрывается", создавая множество более мелких, более стабильных капель. Новые капли подвергаются десольватации, а затем дальнейшему кулоновскому делению. Во время деления капля теряет небольшой процент своей массы (1,0–2,3%) вместе с относительно большим процентом своего заряда (10–18%). Существуют две основные теории, объясняющие конечное образование ионов газовой фазы: модель ионного испарения (IEM) и модель остаточного заряда (CRM). IEM предполагает, что по мере того, как капля достигает определенного радиуса, напряженность поля на ее поверхности становится достаточно большой, чтобы способствовать полевой десорбции сольватированных ионов. CRM предполагает, что капли электроспрея проходят циклы испарения и деления, в конечном итоге приводя к дочерним каплям, которые содержат в среднем один ион аналита или меньше, в то время как более крупные ионы (например, из свернутых белков) образуются посредством механизма остаточного заряда. Предложена третья модель, основанная на комбинированной эмиссии остаточного заряда. Другая модель, называемая моделью выброса цепи (CEM), предлагается для неупорядоченных полимеров (развернутых белков). Ионы, наблюдаемые с помощью масс-спектрометрии, могут быть квазимолекулярными ионами, образованными путем добавления катиона водорода и обозначаемыми [M + H]⁺, или другого катиона, такого как ион натрия, [M + Na]⁺, или удаления ядра водорода, [M – H]⁻. Часто наблюдаются многозарядные ионы, такие как [M + nH]ⁿ⁺. Для крупных макромолекул может быть много состояний заряда, что приводит к характерной оболочке состояний заряда. Все они являются ионами с четным числом электронов: электроны (сами по себе) не добавляются или удаляются, в отличие от некоторых других источников ионизации. Аналиты иногда участвуют в электрохимических процессах, что приводит к смещению соответствующих пиков в масс-спектре. Этот эффект демонстрируется при прямой ионизации благородных металлов, таких как медь, серебро и золото, с использованием электроспрея. Эффективность образования ионов газовой фазы для малых молекул в ESI варьируется в зависимости от структуры соединения, используемого растворителя и инструментальных параметров. Различия в эффективности ионизации достигают более чем 1 миллиона раз.

The liquid containing the analytes of interest (typically 10 6 10 4 M needed ) is dispersed by electrospray, into a fine aerosol. Because the ion formation involves extensive solvent evaporation (also termed desolvation), the typical solvents for electrospray ionization are prepared by mixing water with volatile organic compounds (e. g. methanol acetonitrile). To decrease the initial droplet size, compounds that increase the conductivity (e. g. acetic acid) are customarily added to the solution. These species also act to provide a source of protons to facilitate the ionization process. Large flow electrosprays can benefit from nebulization of a heated inert gas such as nitrogen or carbon dioxide in addition to the high temperature of the ESI source. The aerosol is sampled into the first vacuum stage of a mass spectrometer through a capillary carrying a potential difference of approximately 3000V, which can be heated to aid further solvent evaporation from the charged droplets. The solvent evaporates from a charged droplet until it becomes unstable upon reaching its Rayleigh limit. At this point, the droplet deforms as the electrostatic repulsion of like charges, in an ever decreasing droplet size, becomes more powerful than the surface tension holding the droplet together. At this point the droplet undergoes Coulomb fission, whereby the original droplet 'explodes' creating many smaller, more stable droplets. The new droplets undergo desolvation and subsequently further Coulomb fissions. During the fission, the droplet loses a small percentage of its mass (1.0–2.3%) along with a relatively large percentage of its charge (10–18%). There are two major theories that explain the final production of gas phase ions: the ion evaporation model (IEM) and the charge residue model (CRM). The IEM suggests that as the droplet reaches a certain radius the field strength at the surface of the droplet becomes large enough to assist the field desorption of solvated ions. The CRM suggests that electrospray droplets undergo evaporation and fission cycles, eventually leading progeny droplets that contain on average one analyte ion or less. while larger ions (from folded proteins for instance) form by charged residue mechanism. A third model invoking combined charged residue field emission has been proposed. Another model called chain ejection model (CEM) is proposed for disordered polymers (unfolded proteins). The ions observed by mass spectrometry may be quasimolecular ions created by the addition of a hydrogen cation and denoted [M + H]+, or of another cation such as sodium ion, [M + Na]+, or the removal of a hydrogen nucleus, [M − H]−. Multiply charged ions such as [M + nH]n+ are often observed. For large macromolecules, there can be many charge states, resulting in a characteristic charge state envelope. All these are even electron ion species: electrons (alone) are not added or removed, unlike in some other ionization sources. The analytes are sometimes involved in electrochemical processes, leading to shifts of the corresponding peaks in the mass spectrum. This effect is demonstrated in the direct ionization of noble metals such as copper, silver and gold using electrospray. The efficiency of generating the gas phase ions for small molecules in ESI varies depending on the compound structure, the solvent used and instrumental parameters. The differences in ionization efficiency reach more than 1 million times.

Варианты

Электрораспылители, работающие при низких скоростях потока, генерируют значительно более мелкие начальные капли, что обеспечивает повышенную эффективность ионизации. В 1993 году Гейл и Ричард Д. Смит сообщили, что значительное увеличение чувствительности можно достичь при использовании более низких скоростей потока, вплоть до 200 нл/мин. В 1994 году две исследовательские группы предложили название микроэлектроспрей (microspray) для электрораспылителей, работающих при низких скоростях потока. Emmett и Caprioli продемонстрировали улучшенные результаты анализа HPLC-MS при работе электрораспылителя при 300–800 нл/мин. Wilm и Mann показали, что капиллярный поток около 25 нл/мин может поддерживать электрораспыление на кончике излучателей, изготовленных путем вытягивания стеклянных капилляров до нескольких микрометров. Последний был переименован в наноэлектроспрей (nanospray) в 1996 году. В настоящее время название nanospray также используется для электрораспылителей, подаваемых насосами с низкими скоростями потока, а не только для самораспыляемых электрораспылителей. Хотя чётко определённого диапазона скоростей потока для электрораспыления, микроэлектроспрея и наноэлектроспрея может и не быть, исследователи изучали "изменения в распределении аналита во время деления капель перед высвобождением ионов" и измеряли отношение интенсивности сигнала [Ba2+ + Ba+]/[BaBr+] при различных скоростях потока. Холодная ионизация распылением – это разновидность электрораспыления, при которой раствор, содержащий образец, пропускается через небольшой охлаждаемый капилляр (10–80 °C) в электрическое поле для создания мелкодисперсного тумана холодных заряженных капель. Области применения этого метода включают анализ хрупких молекул и взаимодействий гость-хозяин, которые невозможно изучать с помощью обычной ионизации электрораспылением. Электрораспыление также достигается при давлениях до 25 торр и называется ионизацией при суб-атмосферном давлении с наноэлектроспреем (SPIN), основанной на двухступенчатом ионно-воронкообразном интерфейсе, разработанном Ричардом Д. Смитом и его коллегами. Реализация SPIN обеспечила повышенную чувствительность благодаря использованию ионных воронок, которые способствовали удержанию и переносу ионов в область более низкого давления масс-спектрометра. Наноэлектроспрейный излучатель изготавливается из тонкого капилляра с небольшим отверстием около 1–3 микрометра. Для обеспечения достаточной проводимости капилляр обычно напыляется проводящим материалом, например, золотом. Наноэлектроспрейная ионизация потребляет всего несколько микролитров образца и формирует более мелкие капли. Работа при низком давлении оказалась особенно эффективной для низких скоростей потока, поскольку меньший размер капель электрораспыления позволял достичь эффективной десольватации и образования ионов. В результате исследователи впоследствии смогли продемонстрировать достижение эффективности использования ионизации более 50% для переноса ионов из жидкой фазы в газовую фазу в виде ионов и через двухступенчатый ионно-воронкообразный интерфейс в масс-спектрометр.

The electrosprays operated at low flow rates generate much smaller initial droplets, which ensure improved ionization efficiency. In 1993 Gale and Richard D. Smith reported significant sensitivity increases could be achieved using lower flow rates, and down to 200 nL/min. In 1994, two research groups coined the name micro electrospray (microspray) for electrosprays working at low flow rates. Emmett and Caprioli demonstrated improved performance for HPLC MS analyses when the electrospray was operated at 300–800 nL/min. Wilm and Mann demonstrated that a capillary flow of ~ 25 nL/min can sustain an electrospray at the tip of emitters fabricated by pulling glass capillaries to a few micrometers. The latter was renamed nano electrospray (nanospray) in 1996. Currently the name nanospray is also in use for electrosprays fed by pumps at low flow rates, not only for self fed electrosprays. Although there may not be a well defined flow rate range for electrospray, microspray, and nano electrospray, studied "changes in analyte partition during droplet fission prior to ion release". and then measure the signal intensity ratio [Ba2+ + Ba+]/[BaBr+] at different flow rates. Cold spray ionization is a form of electrospray in which the solution containing the sample is forced through a small cold capillary (10–80 °C) into an electric field to create a fine mist of cold charged droplets. Applications of this method include the analysis of fragile molecules and guest host interactions that cannot be studied using regular electrospray ionization. Electrospray ionization has also been achieved at pressures as low as 25 torr and termed subambient pressure ionization with nanoelectrospray (SPIN) based upon a two stage ion funnel interface developed by Richard D. Smith and coworkers. The SPIN implementation provided increased sensitivity due to the use of ion funnels that helped confine and transfer ions to the lower pressure region of the mass spectrometer. Nanoelectrospray emitter is made out of a fine capillary with a small aperture about 1–3 micrometer. For sufficient conductivity this capillary is usually sputter coated with conductive material, e. g. gold. Nanoelectrospray ionization consumes only a few microliters of a sample and forms smaller droplets. Operation at low pressure was particularly effective for low flow rates where the smaller electrospray droplet size allowed effective desolvation and ion formation to be achieved. As a result, the researchers were later able to demonstrate achieving an excess of 50% overall ionization utilization efficiency for transfer of ions from the liquid phase, into the gas phase as ions, and through the dual ion funnel interface to the mass spectrometer.

Ионизация окружающей среды

При ионизации окружающей среды образование ионов происходит вне масс-спектрометра без подготовки образца. Электрораспыление используется для образования ионов в ряде источников ионов окружающей среды. Десорбционная электрораспылительная ионизация (DESI) – это метод ионизации окружающей среды, в котором струя электрораспыленного растворителя направляется на образец. Электрораспыление притягивается к поверхности путем подачи напряжения на образец. Соединения образца извлекаются в растворитель, который затем снова превращается в аэрозоль в виде сильно заряженных капель, которые испаряются, образуя сильно заряженные ионы. После ионизации ионы поступают в интерфейс масс-спектрометра, работающего при атмосферном давлении. DESI позволяет проводить ионизацию образцов при атмосферном давлении с минимальной подготовкой образца. Экстрактивная электрораспылительная ионизация – это метод ионизации окружающей среды, использующий два объединенных распыления, одно из которых создается электрораспылением. При ионизации бумажным распылением образец наносится на лист бумаги, добавляется растворитель и на бумагу подается высокое напряжение, что приводит к образованию ионов.

Приложения

Электроспрей используется для изучения фолдинга белков.

Жидкая хроматография

Электрораспылительная ионизация является предпочтительным источником ионов для сочетания жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS). Анализ может проводиться в режиме онлайн, подавая жидкость, выходящую из хроматографической колонки, непосредственно в электрораспылитель, или в автономном режиме, собирая фракции для последующего анализа с использованием классической наноэлектрораспылительной масс-спектрометрии. Среди множества рабочих параметров в масс-спектрометрии с электрораспылением (ESI MS), особенно при анализе белков, напряжение электрораспыления было определено как важный параметр, который необходимо учитывать при градиентном элюировании в LC/MS ESI. Изучено влияние различных составов растворителей (например, ТФА или ацетата аммония, или дериватизирующих групп) и условий распыления на спектры LC-MS и/или нано-ESI MS.

Капилярная электрофореза-массовая спектрометрия (CE-MS)

Капилярный электрофорез с масс-спектрометрией стал возможен благодаря интерфейсу ESI, разработанному и запатентованному Ричардом Д. Смитом и его коллегами из Тихоокеанской Северо-Западной национальной лаборатории, и продемонстрировал широкую применимость для анализа смесей очень малых количеств биологических и химических соединений, и даже отдельных биологических клеток.

Нековалентные взаимодействия газовой фазы

Электрораспылительная ионизация также используется для изучения нековалентных взаимодействий в газовой фазе. Считается, что процесс электрораспыления способен переносить нековалентные комплексы из жидкой фазы в газовую, не нарушая нековалентные связи. При изучении комплексов лиганд-субстрат с помощью ESI MS или nanoESI MS были выявлены проблемы, такие как неспецифические взаимодействия. Интересным примером является изучение взаимодействий между ферментами и лекарственными препаратами, являющимися ингибиторами этих ферментов. Конкурентные исследования между STAT6 и ингибиторами использовали ESI для скрининга потенциальных новых лекарственных кандидатов. Электрораспылительная ионизация может даже применяться для изучения белковых комплексов с молекулярной массой более 1 MDa.