Введение
Методы, работающие с ДНК или РНК, и белковые методы – это техники, используемые для изучения белков. Существуют экспериментальные методы изучения белков (например, для обнаружения белков, для их изоляции и очистки, а также для характеристики структуры и функции белков, которые часто требуют предварительной очистки белка). Вычислительные методы обычно используют компьютерные программы для анализа белков. Однако многие экспериментальные методы (например, масс-спектрометрия) требуют вычислительного анализа первичных данных.
Protein methods are the techniques used to study proteins. There are experimental methods for studying proteins (e. g., for detecting proteins, for isolating and purifying proteins, and for characterizing the structure and function of proteins, often requiring that the protein first be purified). Computational methods typically use computer programs to analyze proteins. However, many experimental methods (e. g., mass spectrometry) require computational analysis of the raw data.
Генетические методы
Экспериментальный анализ белков обычно требует экспрессии и очистки белков. Экспрессия достигается путем манипулирования ДНК, кодирующей интересующий(ие) белок(и). Следовательно, для анализа белков обычно требуются методы ДНК, особенно клонирование. Некоторые примеры генетических методов включают концептуальный трансляцию, сайт-направленный мутагенез, использование белка-слияния и сопоставление аллелей с состояниями заболеваний. Некоторые белки никогда не были секвенированы напрямую, однако путем трансляции кодонов из известных последовательностей мРНК в аминокислоты с помощью метода, известного как концептуальная трансляция, можно определить их аминокислотную последовательность. (См. генетический код.) Сайт-направленный мутагенез избирательно вводит мутации, изменяющие структуру белка. Функцию частей белков можно лучше понять, изучая изменение фенотипа в результате этих изменений. Белки-слияния создаются путем встраивания белковых меток, таких как His-метка, для получения модифицированного белка, за которым легче следить. Примером может служить GFP Snf2H, состоящий из белка, связанного с зеленым флуоресцентным белком, образуя гибридный белок. Анализ ДНК-аллелей позволяет выявить их связь с состояниями заболеваний, например, при расчете оценок LOD.
Экстракция белка из тканей
Экстракция белка из тканей с плотной внеклеточной матрицей (например, образцы биопсии, венозные ткани, хрящ, кожа) часто осуществляется в лаборатории путем измельчения в жидком азоте. Образцы замораживают в жидком азоте и затем подвергают ударному или механическому измельчению. Поскольку вода в образцах становится очень хрупкой при этих температурах, образцы обычно превращаются в совокупность мелких фрагментов, которые затем можно растворить для экстракции белка. Для этой цели иногда используются устройства из нержавеющей стали, известные как тканевые пульверизаторы. Преимущества этих устройств включают высокую эффективность извлечения белка из небольших, ценных образцов, а недостатки – низкий уровень перекрестного загрязнения.
Обнаружение белков
Из-за относительно небольшого размера макромолекул белков идентификация и количественная оценка образцов неизвестных белков особенно затруднена. Для упрощения этого процесса разработано несколько надежных методов количественного определения белка. К ним относятся метод Варбурга-Кристиана, метод Лоури и метод Брэдфорда (все они основаны на абсорбционных свойствах макромолекул). Метод Брэдфорда использует краситель для связывания с белком. Чаще всего применяется краситель Coomassie brilliant blue G 250. Краситель в свободном состоянии имеет красный цвет, но при связывании с белком становится синим. Комплекс красителя и белка максимально поглощает свет на длине волны 595 нанометров и чувствителен к образцам, содержащим от 1 до 60 мкг. В отличие от методов Лоури и Варбурга-Кристиана, метод Брэдфорда не зависит от содержания триптофана и тирозина в белках, что теоретически повышает его точность. Метод Лоури аналогичен биоретному анализу, но использует реактив Фолина, который обеспечивает более точную количественную оценку. Реактив Фолина стабилен только в кислых условиях, и результаты метода могут быть искажены в зависимости от количества триптофана и тирозина в исследуемом белке. Реактив Фолина связывается с триптофаном и тирозином, поэтому концентрация этих двух аминокислот влияет на чувствительность метода. Чувствительность метода сопоставима с методом Брэдфорда, но требует немного большего количества белка. Метод Варбурга-Кристиана определяет белки в их естественных диапазонах поглощения. Большинство белков хорошо поглощают свет при 280 нанометрах из-за присутствия триптофана и тирозина, однако метод чувствителен к варьирующемуся содержанию этих аминокислот. Ниже приведены другие методы со ссылками на более подробное описание каждого из них.