Редактирование РНК: молекулярные механизмы и методы исследования.

Введение

Молекулярный процесс

Редактирование РНК (также модификация РНК) — это молекулярный процесс, посредством которого некоторые клетки могут вносить дискретные изменения в специфические нуклеотидные последовательности внутри молекулы РНК после её синтеза РНК-полимеразой. Оно встречается во всех живых организмах и является одним из наиболее эволюционно консервативных свойств РНК. Редактирование РНК может включать вставку, удаление и замену нуклеотидов в молекуле РНК. Редактирование РНК относительно редко, в то время как распространенные формы процессинга РНК (например, сплайсинг, 5'-кэпирование и 3'-полиаденилирование) обычно не рассматриваются как редактирование. Оно может влиять на активность, локализацию и стабильность РНК и связано с человеческими заболеваниями. Редактирование РНК наблюдается в некоторых молекулах тРНК, рРНК, мРНК или миРНК эукариот и их вирусов, архей и прокариот. Редактирование РНК происходит в ядре клетки, а также в митохондриях и пластидах. У позвоночных редактирование встречается редко и обычно состоит из небольшого числа изменений в последовательности затронутых молекул. В других организмах, таких как головоногие моллюски, может происходить обширное редактирование (пан-редактирование); в некоторых случаях большинство нуклеотидов в последовательности мРНК может быть результатом редактирования. На сегодняшний день описано более 160 типов модификаций РНК. Процессы редактирования РНК демонстрируют большое молекулярное разнообразие, и некоторые из них, по-видимому, являются относительно недавними эволюционными приобретениями, возникшими независимо. Разнообразие явлений редактирования РНК включает модификации нуклеобаз, такие как деаминирование цитидина (C) в уридин (U) и аденозина (A) в инозин (I), а также добавление и вставку нуклеотидов, не соответствующих матрице. Редактирование РНК в мРНК эффективно изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка, отличающуюся от предсказанной геномной последовательностью ДНК.

Секвенирование следующего поколения

Для выявления разнообразных посттранскрипционных модификаций молекул РНК и определения транскриптомового ландшафта модификаций РНК с помощью секвенирования РНК следующего поколения, в последнее время многие исследования разработали традиционные или специализированные методы секвенирования (m6A seq, PA m5C seq, метилирование iCLIP, m6A CLIP, Pseudo seq, Ψ seq, CeU seq, Aza IP и RiboMeth seq). Многие из этих методов основаны на специфическом захвате видов РНК, содержащих конкретную модификацию, например, посредством связывания антител с последующим секвенированием захваченных фрагментов. После секвенирования эти фрагменты сопоставляются с полной транскриптомой, чтобы определить их происхождение. Как правило, с помощью такого подхода можно определить местоположение модификаций, а также выявить возможные консенсусные последовательности, которые могут помочь в дальнейшей идентификации и картировании. Одним из примеров специализированных методов является PA m5C seq. Этот метод был разработан на основе метода PA m6A seq для идентификации модификаций m5C на мРНК вместо первоначальной цели – N6-метиладенозина. Легкий переход между различными модификациями в качестве мишени обеспечивается простой заменой антитела для захвата с m6A-специфичного на m5C-специфичное. Зачастую модификации приводят к увеличению массы нуклеозида, что дает характерный сигнал для нуклеозида и его модифицированного аналога.

Модификация РНК-мессенджера

Недавно функциональные эксперименты выявили множество новых функциональных ролей модификаций РНК. Большинство модификаций РНК обнаруживаются в транспортной РНК и рибосомной РНК, но также показано, что эукариотическая мРНК модифицируется множеством различных модификаций. Идентифицировано 17 естественных модификаций мРНК, среди которых N6-метиладенозин является наиболее распространенной и изученной. Модификации мРНК связаны со многими клеточными функциями. Они обеспечивают правильное созревание и функционирование мРНК, но также действуют как часть иммунной системы клетки. Определенные модификации, такие как 2'-O-метилированные нуклеотиды, ассоциированы со способностью клеток различать собственную мРНК и чужеродную РНК. Например, было предсказано, что m6A влияет на трансляцию и локализацию белка, а также на альтернативный выбор сайта полиаденилирования. Псевдоуридилирование стоп-кодонов подавляет терминацию трансляции как in vitro, так и in vivo, что позволяет предположить, что модификация РНК может предоставить новый способ расширения генетического кода. 5-метилцитозин, с другой стороны, связан с транспортом мРНК из ядра в цитоплазму и усилением трансляции. Эти функции m5C не полностью изучены и доказаны, но одним из весомых аргументов в их пользу является наблюдаемая локализация m5C в области инициации трансляции. Важно отметить, что многие модифицирующие ферменты дисрегулированы и генетически мутируют при многих заболеваниях, включая врожденную дискератоз. По сравнению с модификациями, идентифицированными в других типах РНК, таких как тРНК и рРНК, количество идентифицированных модификаций мРНК относительно невелико. Одной из основных причин недостаточной изученности модификаций мРНК является отсутствие необходимых исследовательских методик. Помимо недостатка идентифицированных модификаций, знания об ассоциированных белках также отстают от таковых для других видов РНК. Модификации являются результатом специфических взаимодействий ферментов с молекулой РНК. По этим причинам в последнее десятилетие наблюдается огромный интерес к изучению этих модификаций и их функций. Модификации тРНК играют важную роль в поддержании эффективности трансляции за счет поддержания структуры, взаимодействий антикодон-кодон и взаимодействий с ферментами. Модификации антикодона важны для правильного декодирования мРНК. Поскольку генетический код вырожден, модификации антикодона необходимы для корректного декодирования мРНК. В частности, так называемая «колеблющаяся» позиция антикодона определяет, как считываются кодоны. Например, у эукариот аденозин в позиции 34 антикодона может быть преобразован в инозин. Инозин – это модификация, способная образовывать пары с цитозином, аденином и уридином. Другой часто модифицируемой базой в тРНК является положение, непосредственно прилегающее к антикодону. Позиция 37 часто гипермодифицируется объемными химическими модификациями. Эти модификации предотвращают сдвиг рамки считывания и повышают стабильность связывания антикодон-кодон за счет стекинговых взаимодействий. Химические модификации рРНК включают метилирование рибозных сахаров, изомеризацию уридинов, а также метилирование и ацетилирование отдельных оснований.

Recently, functional experiments have revealed many novel functional roles of RNA modifications. Most of the RNA modifications are found on transfer RNA and ribosomal RNA, but also eukaryotic mRNA has been shown to be modified with multiple different modifications. 17 naturally occurring modifications on mRNA have been identified, from which the N6 methyladenosine is the most abundant and studied. mRNA modifications are linked to many functions in the cell. They ensure the correct maturation and function of the mRNA, but also at the same time act as part of cell's immune system. Certain modifications like 2’O methylated nucleotides has been associated with cells ability to distinguish own mRNA from foreign RNA. For example, m6A has been predicted to affect protein translation and localization, alternative polyA choice Pseudouridylation of nonsense codons suppresses translation termination both in vitro and in vivo, suggesting that RNA modification may provide a new way to expand the genetic code. 5 methylcytosine on the other hand has been associated with mRNA transport from the nucleus to the cytoplasm and enhancement of translation. These functions of m5C are not fully known and proven but one strong argument towards these functions in the cell is the observed localization of m5C to translation initiation site. Importantly, many modification enzymes are dysregulated and genetically mutated in many disease types. and dyskeratosis congenital. Compared to the modifications identified from other RNA species like tRNA and rRNA, the amount of identified modifications on mRNA is very small. One of the biggest reasons why mRNA modifications are not so well known is missing research techniques. In addition to the lack of identified modifications, the knowledge of associated proteins is also behind other RNA species. Modifications are results of specific enzyme interactions with the RNA molecule. For these reasons there has been during the past decade huge interest in studying these modifications and their function. Modifications in tRNA play crucial roles in maintaining translation efficiency through supporting structure, anticodon codon interactions, and interactions with enzymes. Anticodon modifications are important for proper decoding of mRNA. Since the genetic code is degenerate, anticodon modifications are necessary to properly decode mRNA. Particularly, the wobble position of the anticodon determines how the codons are read. For example, in eukaryotes an adenosine at position 34 of the anticodon can be converted to inosine. Inosine is a modification that is able to base pair with cytosine, adenine, and uridine. Another commonly modified base in tRNA is the position adjacent to the anticodon. Position 37 is often hypermodified with bulky chemical modifications. These modifications prevent frameshifting and increase anticodon codon binding stability through stacking interactions. Chemical modification in rRNA consists of methylation of ribose sugars, isomerization of uridines, and methylation and acetylation of individual bases.

Метилирование

Метилирование рРНК поддерживает структурную жесткость, блокируя наложение пар оснований и защищая 2'-ОН группу от гидролиза. Оно происходит в определенных участках эукариотической рРНК. Шаблон для метилирования состоит из 10-21 нуклеотидов. Метилирование в основном вводится малыми нуклеолярными РНК, называемыми snoRNP. Существуют два класса snoRNP, нацеленных на участки метилирования, известные как box C/D и box H/ACA. H/ACA box snoRNP вводят направляющие последовательности длиной около 14-15 нуклеотидов. Поскольку это может затрагивать значительную часть сайтов в гене, это иногда называют "пан-редактированием", чтобы отличить его от топического редактирования одного или нескольких сайтов. Пан-редактирование начинается с комплементарного спаривания оснований нередактированной первичной транскрипции с направляющей РНК (gRNA), содержащей комплементарные последовательности к областям вокруг точек вставки/удаления. Затем новообразованная двухцепочечная область охватывается редактосомой – крупным мультипротеиновым комплексом, который катализирует редактирование. Редактосома раскрывает транскрипт в точке первого неспаренного нуклеотида и начинает вставлять уридины. Вставленные уридины комплементарно спариваются с направляющей РНК, и вставка продолжается до тех пор, пока в направляющей РНК присутствуют A или G, и останавливается при обнаружении C или U. Вставленные нуклеотиды вызывают сдвиг рамки считывания, что приводит к образованию транслируемого белка, отличающегося от кодируемого геном. Механизм редактосомы включает эндонуклеотический разрез в точке неспаривания между направляющей РНК и нередактированной транскрипцией. Следующий этап катализируется одним из ферментов комплекса – терминальной U-трансферазой, которая добавляет U от UTP к 3'-концу мРНК. Раскрытые концы удерживаются на месте другими белками комплекса. Другой фермент, U-специфическая экзорибонуклеаза, удаляет неспаренные U. После того, как редактирование сделало мРНК комплементарной gRNA, РНК-лигаза соединяет концы отредактированной мРНК-транскрипции. Следовательно, редактосома может редактировать только в направлении 3' → 5' вдоль первичной РНК-транскрипции. Комплекс может действовать только с одной направляющей РНК за раз. Поэтому для РНК-транскрипта, требующего обширного редактирования, потребуется более одной направляющей РНК и комплекса редактосомы.

Methylation of rRNA upholds structural rigidity by blocking base pair stacking and surrounds the 2’ OH group to block hydrolysis. It occurs at specific parts of eukaryotic rRNA. The template for methylation consists of 10 21 nucleotides. Methylation is primarily introduced by small nucleolar RNA's, referred to as snoRNPs. There are two classes of snoRNPs that target methylation sites, and they are referred to box C/D and box H/ACA. The H/ACA box snoRNPs introduce guide sequences that are about 14 15 nucleotides long. Because this may involve a large fraction of the sites in a gene, it is sometimes called "pan editing" to distinguish it from topical editing of one or a few sites. Pan editing starts with the base pairing of the unedited primary transcript with a guide RNA (gRNA), which contains complementary sequences to the regions around the insertion/deletion points. The newly formed double stranded region is then enveloped by an editosome, a large multi protein complex that catalyzes the editing. The editosome opens the transcript at the first mismatched nucleotide and starts inserting uridines. The inserted uridines will base pair with the guide RNA, and insertion will continue as long as A or G is present in the guide RNA and will stop when a C or U is encountered. The inserted nucleotides cause a frameshift, and result in a translated protein that differs from its gene. The mechanism of the editosome involves an endonucleolytic cut at the mismatch point between the guide RNA and the unedited transcript. The next step is catalyzed by one of the enzymes in the complex, a terminal U transferase, which adds Us from UTP at the 3' end of the mRNA. The opened ends are held in place by other proteins in the complex. Another enzyme, a U specific exoribonuclease, removes the unpaired Us. After editing has made mRNA complementary to gRNA, an RNA ligase rejoins the ends of the edited mRNA transcript. As a consequence, the editosome can edit only in a 3' to 5' direction along the primary RNA transcript. The complex can act on only a single guide RNA at a time. Therefore, a RNA transcript requiring extensive editing will need more than one guide RNA and editosome complex.

Редактирование с C-to-U

Редактирование включает цитидиндеаминазу, которая деаминирует цитидиновый остаток в уридиновый остаток. Примером редактирования C в U является ген аполипопротеина B у человека. Apo B100 экспрессируется в печени, а apo B48 – в кишечнике. В кишечнике последовательность CAA в мРНК редактируется до UAA, стоп-кодона, что приводит к образованию более короткой формы B48. Редактирование C-U часто происходит в митохондриальной РНК цветковых растений. Разные растения демонстрируют различную степень редактирования C-U; например, в митохондриях мха Funaria hygrometrica происходит восемь событий редактирования, в то время как в ликофитах Isoetes engelmanii – более 1700. Редактирование C-U осуществляется членами семейства белков с пентатрикопептидными повторами (PPR). Цветковые растения обладают крупными семействами PPR, которые выступают в роли транс-факторов для цис-элементов, не имеющих консенсусной последовательности; у Arabidopsis насчитывается около 450 членов семейства PPR. Белки PPR были обнаружены как в пластидах, так и в митохондриях.

Редактирование A-to-I

Модификации аденозина в инозин (A-I) вносят вклад почти в 90% всех событий редактирования в РНК. Деаминирование аденозина катализируется двуцепочечной РНК-специфической аденозин-деаминазой (ADAR), которая обычно действует на пре-мРНК. Деаминирование аденозина в инозин нарушает и дестабилизирует спаривание оснований двуцепочечной РНК, тем самым снижая способность данной двуцепочечной РНК производить малые интерферирующие РНК (siRNA), которые вмешиваются в путь РНК-интерференции (RNAi). Колебательное спаривание оснований приводит к тому, что деаминированная РНК приобретает уникальную, но отличную структуру, которая может быть связана с ингибированием стадии инициации трансляции РНК. Исследования показали, что I-РНК (РНК с множеством повторов основания I-U) рекрутирует метилазы, участвующие в формировании гетерохроматина, и что эта химическая модификация значительно мешает участкам связывания микроРНК (miRNA). Ведутся активные исследования важности модификаций A-I и их роли в новой концепции эпитранскриптомики, где модификации РНК изменяют их функцию. Давно установленным следствием A-I в мРНК является интерпретация I как G, что приводит к функциональной замене A на G, например, при декодировании генетического кода рибосомами. Однако более поздние исследования ослабили эту корреляцию, показав, что инозины также могут декодироваться рибосомой (хотя и в меньшей степени) как аденозины или урацилы. Кроме того, было показано, что I приводит к остановке рибосом на I-обогащенной мРНК. Развитие высокопроизводительного секвенирования в последние годы позволило создать обширные базы данных различных модификаций и редактирования РНК. RADAR (Строго аннотированная база данных редактирования РНК A-I) была разработана в 2013 году для каталогизации огромного разнообразия сайтов A-I и тканеспецифических уровней их экспрессии у людей, мышей и мух. В базу данных постоянно добавляются новые сайты и вносятся общие изменения. Уровень редактирования для конкретных сайтов редактирования, например, в транскрипте филамина А, является тканеспецифичным. Эффективность сплайсинга мРНК является основным фактором, контролирующим уровень редактирования РНК A-I. Интересно, что ADAR1 и ADAR2 также влияют на альтернативный сплайсинг как посредством способности к редактированию A-I, так и посредством способности связывать двуцепочечную РНК.

Adenosine to inosine (A to I) modifications contribute to nearly 90% of all editing events in RNA. The deamination of adenosine is catalyzed by the double stranded RNA specific adenosine deaminase (ADAR), which typically acts on pre mRNAs. The deamination of adenosine to inosine disrupts and destabilizes the dsRNA base pairing, therefore rendering that particular dsRNA less able to produce siRNA, which interferes with the RNAi pathway. The wobble base pairing causes deaminated RNA to have a unique but different structure, which may be related to the inhibition of the initiation step of RNA translation. Studies have shown that I RNA (RNA with many repeats of the I U base pair) recruits methylases that are involved in the formation of heterochromatin and that this chemical modification heavily interferes with miRNA target sites. There is active research into the importance of A to I modifications and their purpose in the novel concept of epitranscriptomics, in which modifications are made to RNA that alter their function. A long established consequence of A to I in mRNA is the interpretation of I as a G, therefore leading to functional A to G substitution, e. g. in the interpretation of the genetic code by ribosomes. Newer studies, however, have weakened this correlation by showing that inosines can also be decoded by the ribosome (although in a lesser extent) as adenosines or uracils. Furthermore, it was shown that I's lead to the stalling of ribosomes on the I rich mRNA. The development of high throughput sequencing in recent years has allowed for the development of extensive databases for different modifications and edits of RNA. RADAR (Rigorously Annotated Database of A to I RNA editing) was developed in 2013 to catalog the vast variety of A to I sites and tissue specific levels present in humans, mice, and flies. The addition of novel sites and overall edits to the database are ongoing. The level of editing for specific editing sites, e. g. in the filamin A transcript, is tissue specific. The efficiency of mRNA splicing is a major factor controlling the level of A to I RNA editing. Interestingly, ADAR1 and ADAR2 also affect alternative splicing via both A to I editing ability and dsRNA binding ability.

Альтернативное редактирование мРНК

Впервые об альтернативном редактировании U-C мРНК сообщалось в транскриптах WT1 (ген Вильмса 1), а неклассические изменения G-A в мРНК впервые были обнаружены в транскриптах HNRNPK (гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин K) как в злокачественных, так и в нормальных образцах ткани толстой кишки. Позднее эти изменения также были выявлены совместно с неклассическими изменениями U-C в транскриптах TPH2 (триптофан гидроксилаза 2) клеток мозга. Хотя обратное аминирование может быть наиболее простым объяснением изменений U-C, для событий редактирования U-C в митохондриальных транскриптах были предложены механизмы трансаминации и трансгликозилирования. Недавнее исследование сообщило о новых изменениях G-A в мРНК в транскриптах WT1 в двух горячих точках, предполагая, что APOBEC3A (аполипопротеин B мРНК-редактирующий фермент, каталитический полипептид 3A) является ферментом, участвующим в этом классе альтернативного редактирования мРНК. Также было показано, что альтернативные изменения мРНК связаны с каноническими вариантами сплайсинга WT1, что свидетельствует об их функциональной значимости.

Редактирование РНК в митохондриях и пластидах растений

В предыдущих исследованиях было показано, что единственными типами редактирования РНК, наблюдаемыми в митохондриях и пластидах растений, являются превращение C в U и U в C (очень редко). Сайты редактирования РНК в основном находятся в кодирующих областях мРНК, интронах и других не транслируемых областях. Идентичность и организация всех белков, составляющих эдитосому, до сих пор не установлены. Показано, что члены обширного семейства белков PPR функционируют как трансактивирующие факторы для распознавания последовательностей РНК. Определенные члены семейства MORF (Multiple Organellar RNA editing Factor) также необходимы для правильного редактирования в нескольких сайтах. Поскольку некоторые из этих белков MORF, как было показано, взаимодействуют с членами семейства PPR, возможно, что белки MORF являются компонентами комплекса эдитосомы. Фермент, ответственный за трансаминацию или деаминирование РНК-транскрипта, остается неустановленным, хотя было предложено, что белки PPR могут выполнять эту функцию. Редактирование РНК необходимо для нормального функционирования трансляции и дыхательной активности растения. Редактирование может восстановить важные последовательности спаривания оснований тРНК, восстанавливая их функциональность. Оно также связано с производством белков, редактированных РНК, которые включаются в полипептидные комплексы дыхательной цепи. Следовательно, весьма вероятно, что полипептиды, синтезированные из нередактированных РНК, не будут функционировать должным образом и будут препятствовать активности как митохондрий, так и пластид. Редактирование РНК C-U может создавать стартовые и стоп-кодоны, но не может разрушать существующие стартовые и стоп-кодоны. Криптический стартовый кодон создается, когда кодон ACG редактируется в AUG.

Редактирование РНК в вирусах

Вирусы (например, корь, свинка или парагрипп), особенно вирусы с РНК-геномом, эволюционировали, чтобы использовать модификации РНК различными способами при инфицировании клетки-хозяина. Известно, что вирусы используют модификации РНК на разных этапах своего инфекционного цикла, от уклонения от иммунного ответа до повышения эффективности трансляции белка. Вирусная РНК транскрибируется РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой вирусом, которая склонна к остановкам и "запинкам" при определенных комбинациях нуклеотидов. Кроме того, полимераза добавляет до нескольких сотен нетемплатных аденинов в 3'-конце формирующейся мРНК. Эти аденины способствуют стабилизации мРНК. Более того, остановки и запинки РНК-полимеразы позволяют встраивать один или два гуанина или аденина выше по току от трансляционного кодона. Показано, что модификация N6-метиладенозина в мРНК вируса ZIKV ингибирует репликацию вируса.

Происхождение и эволюция редактирования РНК

Система редактирования РНК, наблюдаемая у животных, вероятно, эволюционировала из мононуклеотидных деаминаз, что привело к образованию более крупных семейств генов, включающих гены *apobec 1* и *adar*. Эти гены демонстрируют тесное сходство с бактериальными деаминазами, участвующими в метаболизме нуклеотидов. Аденозин-деаминаза *E. coli* не способна деаминировать нуклеозид в РНК, поскольку реакционный центр фермента слишком мал для связывания с РНК-цепочкой. Однако, этот активный центр расширяется за счет изменений аминокислотной последовательности в соответствующих человеческих аналогах генов, *APOBEC1* и *ADAR*, что позволяет осуществлять деаминирование. Редактирование, опосредованное gRNA, в митохондриях трипаносом, включающее шаблонное введение остатков U, представляет собой совершенно иную биохимическую реакцию. В других исследованиях было показано, что ферменты, участвующие в этом процессе, были привлечены и адаптированы из различных источников. Однако, специфичность введения нуклеотидов посредством взаимодействия между gRNA и мРНК аналогична процессам редактирования тРНК в митохондриях животных и *Acanthamoeba*. Еукариотическое рибозное метилирование рРНК с помощью направляющих РНК-молекул является схожей формой модификации. Таким образом, редактирование РНК эволюционировало неоднократно. Было предложено несколько адаптивных объяснений редактирования. Часто редактирование описывают как механизм коррекции или восстановления для компенсации дефектов в последовательностях генов. Однако, в случае редактирования, опосредованного gRNA, это объяснение представляется маловероятным, поскольку если дефект возникает первым, то невозможно создать область кодирования gRNA без ошибок, которая, предположительно, возникает в результате дупликации исходной области гена. Более правдоподобной альтернативой эволюционному происхождению этой системы является конструктивная нейтральная эволюция, в которой порядок шагов обратный: способность к редактированию возникает раньше "дефекта".

Редактирование терапевтической мРНК

Направление редактирования для исправления мутировавших последовательностей было впервые предложено и продемонстрировано в 1995 году. В этой первоначальной работе использовались синтетические антисмысленные олигонуклеотиды РНК, комплементарные преждевременному стоп-кодону в последовательности дистрофина, для активации редактирования A в I, преобразующего стоп-кодон в кодон считывания, в модельной клеточной системе ксенопуса. В последнее время CRISPR-Cas13, слитый с деаминазами, стал применяться для направленного редактирования мРНК. В 2022 году было сообщено о терапевтическом редактировании РНК с использованием Cas7-11. Он обеспечивает достаточно точные разрезы, а ранняя версия была использована для in vitro редактирования в 2021 году.

Сравнение с редактированием ДНК

В отличие от редактирования ДНК, которое носит постоянный характер, эффекты редактирования РНК – включая возможные нецелевые мутации в РНК – являются временными и не передаются по наследству. Таким образом, редактирование РНК считается менее опасным. Более того, для его осуществления может потребоваться только направляющая РНК, используя белок ADAR, уже присутствующий в клетках человека и многих других эукариот, вместо необходимости введения в организм чужеродного белка.