Введение

Тип искусственного процесса

Трансдифференциация, также известная как перепрограммирование клеточной линии, – это процесс, в котором одна зрелая соматическая клетка превращается в другую зрелую соматическую клетку, минуя промежуточное плюрипотентное состояние или стадию клеток-предшественников. Это один из видов метаплазии, охватывающий все изменения клеточной судьбы, включая взаимопревращение стволовых клеток. В настоящее время трансдифференциация используется для моделирования заболеваний и поиска лекарственных препаратов, а в будущем может найти применение в генной терапии и регенеративной медицине. Термин «трансдифференциация» был впервые предложен Селманом и Кафатосом в 1974 году для описания изменения свойств клеток, когда клетки, производящие кутикулу, превращались в клетки, секретирующие соль, у шелкопрядов в процессе метаморфоза.

Открытие

Дэвис и др. в 1987 году сообщили о первом зафиксированном случае трансдифференциации, когда клетка изменилась из одного зрелого типа клеток в другой. Было показано, что принудительная экспрессия MyoD в эмбриональных фибробластах мыши является достаточной для превращения этих клеток в миобласты.

Примеры из природы

Единственные известные случаи, когда взрослые клетки напрямую переходят из одной клеточной линии в другую, наблюдаются у видов Turritopsis dohrnii (также известных как бессмертные медузы) и Turritopsis nutricula. У тритонов при удалении хрусталика глаза пигментные эпителиальные клетки дедифференцируются, а затем повторно дифференцируются в клетки хрусталика. Винченцо Колуччи описал это явление в 1891 году, а Густав Вольф – в 1894 году; вопрос приоритета рассматривается в работе Холланда (2021). У людей и мышей было показано, что альфа-клетки поджелудочной железы могут спонтанно изменять свою судьбу и трансдифференцироваться в бета-клетки. Это было продемонстрировано как для здоровых, так и для больных диабетом панкреатических островков человека и мыши. Ранее считалось, что клетки пищевода развиваются в результате трансдифференцировки клеток гладкой мускулатуры, однако это оказалось неверным.

Примеры индукции и терапии

Первый пример функциональной трансдифференциации был представлен Фербером и соавторами, индуцировав изменение судьбы клеток печени и превратив их в клетки, подобные бета-клеткам поджелудочной железы. Клетки подверглись широкому, функциональному и продолжительному процессу трансдифференциации, который снизил эффекты гипергликемии у диабетических мышей. Более того, трансдифференцированные клетки, подобные бета-клеткам, оказались устойчивыми к аутоиммунной атаке, характерной для диабета 1 типа. Вторым этапом стала трансдифференциация на человеческих образцах. Сапир и соавторы, путем трансдукции клеток печени одним геном, смогли индуцировать трансдифференциацию клеток печени человека в бета-клетки человека. Этот подход был продемонстрирован на тканях мышей, крыс, ксенопуса и человека. Схематическая модель процесса трансдифференциации гепатоцитов в бета-клетки. Гепатоциты получают путем биопсии печени у пациента с диабетом, культивируют и расширяют ex vivo, трансдуцируют вирусом PDX1, трансдифференцируют в функциональные инсулин-продуцирующие бета-клетки и пересаживают обратно пациенту. Аналогично, клетки Сертоли в яичках взрослых самцов мышей могут трансдифференцироваться в клетки гранулезы посредством индуцированного нокаута гена DMRT1.

Подход, основанный на родословной

В этом подходе факторы транскрипции из клеток-предшественников целевого типа трансфицируются в соматическую клетку для индуцирования трансдифференцировки, либо начинают с одного-двух факторов и добавляют остальные. Одна из теорий, объясняющих конкретные механизмы, заключается в том, что эктопические факторы транскрипции направляют клетку в более раннее состояние предшественника, а затем перенаправляют ее к новому типу клеток. Реорганизация структуры хроматина посредством метилирования ДНК или модификации гистонов также может играть роль. Ниже приведен список примеров in vitro и in vivo. Методы in vivo трансфекции специфических клеток мышей используют те же типы векторов, что и эксперименты in vitro, за исключением того, что вектор вводится непосредственно в конкретный орган. Например, Чжоу и соавторы (2008) вводили Ngn3, Pdx1 и Mafa в спинную долю селезенки (в область поджелудочной железы) мышей для перепрограммирования экзокриновых клеток поджелудочной железы в β-клетки с целью улучшения состояния гипергликемии.

Подход к начальной фазе эпигенетической активации

Соматические клетки сначала временно трансфицируются плюрипотентными факторами перепрограммирования (Oct4, Sox2, Nanog и др.), а затем – желаемыми ингибирующими или активирующими факторами. Ниже приведен список примеров, полученных in vitro.

Фармакологические агенты

Ингибитор метилирования ДНК, 5-азацитидин, также известен своей способностью стимулировать фенотипическую трансдифференциацию кардиомиоцитов в скелетные миобласты. При раке предстательной железы лечение препаратами, нацеленными на андрогенные рецепторы, индуцирует нейроэндокринную трансдифференциацию у части пациентов. Для этой категории пациентов не существует общепринятых стандартов лечения, и пациентам, у которых диагностирована нейроэндокринная карцинома, вызванная лечением, обычно назначают паллиативную терапию.

Механизм действия

Факторы транскрипции выступают в качестве кратковременного триггера необратимого процесса. Трансдифференциация клеток печени наблюдалась через 8 месяцев после однократной инъекции pdx1. Несмотря на масштабную дедифференциацию, метод прослеживания клеточной линии подтверждает, что трансдифференциация происходит из взрослых клеток.

Алгоритм Mogrify

Определение уникального набора клеточных факторов, требуемых для манипулирования при каждом преобразовании клеток, – это длительный и дорогостоящий процесс, включающий множество проб и ошибок. В результате, этот первый этап – определение ключевого набора клеточных факторов для преобразования клеток – является основным препятствием, с которым сталкиваются исследователи в области перепрограммирования клеток. Международная группа исследователей разработала алгоритм под названием Mogrify, который способен предсказывать оптимальный набор клеточных факторов, необходимых для преобразования одного типа клеток человека в другой. При тестировании Mogrify точно предсказал набор клеточных факторов, необходимых для ранее опубликованных преобразований клеток. Для дальнейшей проверки прогностических возможностей Mogrify команда провела два новых преобразования клеток в лаборатории, используя клетки человека, и оба раза добилась успеха, опираясь исключительно на предсказания Mogrify. Mogrify был предоставлен в открытый доступ онлайн для других исследователей и ученых.

Оценка

При исследовании трансдифференцированных клеток важно выявлять маркеры целевого типа клеток и отсутствие маркеров исходных клеток, что можно осуществить с помощью зеленого флуоресцентного белка или иммунодетекции. Также необходимо изучать функциональные характеристики клеток, профили эпигенома, транскриптома и протеома. Оценка клеток может проводиться и на основе их способности к интеграции в соответствующую ткань in vivo.

Переход от клеток мыши к человеческим

Как правило, трансдифференциация, происходящая в мышиных клетках, не воспроизводится с той же эффективностью и скоростью в человеческих клетках. Пэнг и соавторы обнаружили, что факторы транскрипции Ascl1, Brn2 и Myt1l превращали мышиные клетки в зрелые нейроны, в то время как тот же набор факторов превращал человеческие клетки лишь в незрелые нейроны. Однако добавление NeuroD1 позволило повысить эффективность и способствовало достижению клетками зрелости.

Порядок выражения коэффициента транскрипции

Порядок экспрессии факторов транскрипции может определять судьбу клетки. Ивасаки и др. (2006) показали, что в гематопоэтических линиях время экспрессии Gata 2 и (C/EBPalpha) может влиять на то, смогут ли лимфоидные предшественники дифференцироваться в гранулоцитно-моноцитарные предшественники, эозинофилы, базофилы или бипотентные базофильно-мастоцитарные линии.

Иммуногенность

Было обнаружено, что при введении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мышам, иммунная система сингенной мыши отторгала формирующиеся тератомы. Это может быть частично связано с тем, что иммунная система распознавала эпигенетические маркеры специфических последовательностей введенных клеток. Однако, при введении эмбриональных стволовых клеток, иммунный ответ был значительно слабее. Остается исследовать, будет ли это происходить и с трансдифференцированными клетками. Одним из примеров является невирусная доставка плазмид, кодирующих факторы транскрипции, с использованием полимерного носителя для индуцирования нейронной трансдифференциации фибробластов. При попадании в клетки чужеродных молекул необходимо учитывать возможные недостатки и потенциальный риск развития опухолевого роста. Интегрирующие вирусные векторы могут вызывать мутации при встраивании в геном. Одним из способов избежать этого является удаление вирусного вектора после завершения перепрограммирования, например, с помощью Cre-Lox рекомбинации. Неинтегрирующие векторы имеют другие проблемы, связанные с эффективностью перепрограммирования и удалением вектора. Другие методы – относительно новые области, и многое в них еще предстоит изучить.

Плюрипотентное перепрограммирование

Почти все факторы, перепрограммирующие клетки в плюрипотентность, обнаружены и способны превращать широкий спектр клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Однако многие факторы, способные изменить клеточную линию, остаются не открытыми, и эти факторы действуют только для конкретной линии. Конечные продукты трансдифференцированных клеток пригодны для клинических исследований, в то время как iPSC необходимо дифференцировать. И плюрипотентные, и трансдифференцированные клетки используют взрослые клетки, что делает исходный материал легкодоступным, в отличие от человеческих эмбриональных стволовых клеток, получение которых связано с необходимостью обхода юридических ограничений и этическими вопросами, касающимися исследований стволовых клеток.