Введение
Культивирование органных тканей in vitro
Культура органов – это культивирование целых органов или частей органов in vitro. Это развитие методов исследования культуры тканей, поскольку использование самого органа in vitro позволяет более точно моделировать функции органа в различных состояниях и условиях. Ключевая цель культуры органов – сохранить архитектуру ткани и направить ее к нормальному развитию. В этой технике необходимо избегать любого нарушения или повреждения ткани, что требует осторожного обращения. Среды, используемые для культивирования органов, как правило, такие же, как и для культуры тканей. Методы культивирования органов можно классифицировать на: (i) использующие твердую среду и (ii) использующие жидкую среду. Технология культуры органов способствовала прогрессу в эмбриологии, изучении воспалительных процессов, онкологии и исследованиях стволовых клеток. Энтони Атала из Института регенеративной медицины Вейк-Форест в Уинстоне-Салеме, штат Северная Каролина, культивировал мочевой пузырь. Челюсть была культивирована в Колумбийском университете, легкое – в Йельском университете. Дорис Тейлор из Университета Миннесоты культивировала бьющееся сердце крысы. Искусственную почку вырастил Х. Дэвид Хьюмс в Мичиганском университете. Шелк, полученный из коконов шелкопряда, успешно использовался в качестве каркаса для выращивания сердечной ткани. Сердечная ткань не регенерирует при повреждении, поэтому создание заместительных участков представляет большой интерес. В эксперименте использовались клетки сердца крысы, в результате чего была получена функциональная сердечная ткань. Для дальнейшего тестирования применения для лечения людей необходимо найти способ преобразования человеческих стволовых клеток в сердечную ткань. В 2015 году Харальду Отту удалось вырастить переднюю конечность крысы. Сейчас он работает в лаборатории Отта, которая занимается созданием биоискусственных сердец, легких, трахей и почек. В 2016 году был проведен еще один тест, в котором человеческие клетки использовались для сборки сложно устроенных сердец. Сердца оказались незрелыми, но это продемонстрировало, что мы сделали еще один шаг к созданию сердца из стволовых клеток. В январе 2017 года ученым из Института биологических исследований Солка удалось создать эмбрион свиньи, из которого была удалена часть ДНК, критически важная для роста органов. Затем они ввели человеческие стволовые клетки в эмбрион свиньи, чтобы человеческая ДНК заполнила пробелы.
Культура in vitro
Эмбриональная культура органов – более простая альтернатива обычной культуре органов, полученной из тканей взрослых животных. Далее описаны четыре методики, применяемые для эмбриональной культуры органов.
Метод сгустка плазмы
Ниже приведены общие этапы культивирования органов на плазменных сгустках. Приготовьте плазменный сгусток, смешав 15 капель плазмы с пятью каплями экстракта эмбриона в чашке Петри. Поместите чашку Петри на подушечку из ваты в другой чашке Петри; вату поддерживают во влажном состоянии, чтобы предотвратить чрезмерное испарение из чашки. Поместите небольшой, аккуратно диссецированный фрагмент ткани поверх плазменных сгустков в чашке Петри. В настоящее время методика была модифицирована, и используется подложка из фильтровальной бумаги или раионовой сетки, на которую помещают ткань. Перенос ткани таким образом осуществляется легко. Удалите избыток жидкости и поместите сетку с тканью обратно в свежую порцию среды.
Метод агар-геля
Среды, затвердевшие с помощью агара, также используются для культуры органов, и состоят из 7 частей 1% агара в BSS, 3 частей экстракта зародыша цыпленка и 3 частей конской сыворотки. Определенные среды, с сывороткой или без нее, также используются с агаром. Среда с агаром обеспечивает механическую поддержку при культуре органов и не разжижается. Эмбриональные органы обычно хорошо растут на агаре, но культура органов взрослых организмов на этой среде не выживает. Культивирование органов взрослых организмов или их частей более сложно из-за их повышенной потребности в кислороде. Различные органы взрослых организмов (например, печень) культивировались с использованием специальных сред и специального оборудования (камера культуры Towell's II). Поскольку было обнаружено, что сыворотка токсична, стали использовать среды, не содержащие сыворотки, а специальное оборудование позволяло использовать 95% кислорода.
Методы плотного плавания
При этом эксплант помещают на плот из линзовой бумаги или ацетата целлюлозы, который плавает на сыворотке в чашке Петри. Плот из ацетата целлюлозы заставляют плавать на сыворотке, обрабатывая его четыре угла силиконом. Аналогично, плавучесть линзовой бумаги усиливается обработкой ее силиконом. На каждом плоту обычно размещают четыре или более экспланта. При сочетании метода плота и метода сгустка экспланты сначала помещают на подходящий плот, который затем располагают на плазменном сгустке. Эта модификация облегчает замену среды и предотвращает оседание эксплантов в разжиженной плазме.
Метод сетки
Первоначально разработанный Троуэллом в 1954 году, метод сетки использует фрагменты подходящей проволочной сетки или перфорированного листа из нержавеющей стали размером 25 мм x 25 мм, края которых согнуты для формирования 4 ножек высотой около 4 мм. Скелетные ткани обычно помещают непосредственно на сетку, а более мягкие ткани, такие как железы или кожа, предварительно помещают на подложки (рафты), которые затем устанавливают на сетки. Сами сетки помещают в камеру для культивирования, заполненную жидкой средой до уровня сетки; в камеру подается смесь O2 и CO2 для обеспечения высоких потребностей в O2 органов взрослых млекопитающих. Модификация оригинального метода сетки широко используется для изучения роста и дифференцировки взрослых и эмбриональных тканей.
Применение
Выращенные органы могут стать альтернативой органам от других людей (живых или умерших). Это важно, поскольку количество доступных для трансплантации органов (полученных от доноров) в развитых странах сокращается. Дополнительным преимуществом является то, что выращенные органы, созданные из собственных стволовых клеток пациента, позволяют проводить трансплантацию без необходимости дальнейшего приема иммуносупрессантов.
Ограничения
Результаты, полученные в культурах органов in vitro, часто не сопоставимы с результатами исследований in vivo (например, исследований действия лекарственных средств), поскольку лекарственные препараты метаболизируются in vivo, но не in vitro.