Синтез белка у бактерий: механизмы и особенности инициации и элонгации

Введение

Процесс синтеза белка в бактериях. Бактериальная трансляция — это процесс, в ходе которого информация с матричной РНК (мРНК) используется для синтеза белков в бактериях.

Введение

Инициация трансляции в бактериях включает в себя сборку компонентов системы трансляции, а именно: двух рибосомальных субъединиц (50S и 30S); зрелой мРНК, предназначенной для трансляции; тРНК, заряженной N-формилметионином (первой аминокислотой в начинающемся пептиде); гуанозинтрифосфата (GTP) как источника энергии и трех прокариотических факторов инициации IF1, IF2 и IF3, которые способствуют сборке инициационного комплекса. Следует ожидать вариаций в механизме. Даже в канонической модели существует множество неясностей. Показано, что сайт инициации не строго ограничен кодоном AUG. Хорошо известные кодирующие области, не содержащие кодоны инициации AUG, – это lacI (GUG) и lacA (UUG) в опероне lac у E. coli. Два независимых исследования показали, что 17 или более не-AUG стартовых кодонов могут инициировать трансляцию у E. coli. Тем не менее, AUG, по крайней мере, представляется наиболее эффективным кодоном инициации среди всех возможных. Считается, что этот способ важен для трансляции генов, сгруппированных в полицистронные опероны, где каноничный способ связывания может быть затруднен из-за небольших расстояний между соседними генами на одной молекуле мРНК.

Инициация без лидера

У ряда бактериальных мРНК отсутствует 5'-UTR или он очень короткий. Полная 70S рибосома, с помощью IF2 (обеспечивающей присоединение fMet-тРНК), может просто начать трансляцию такой мРНК, лишенной 5'-UTR.

Удлинение

Удлинение полипептидной цепи включает добавление аминокислот к карбоксильному концу растущей цепи. Растущий белок выходит из рибосомы через полипептидный выходной туннель в большой субъединице. Удлинение начинается, когда fMet-тРНК входит в P-сайт, вызывая конформационное изменение, которое открывает A-сайт для связывания новой аминоацил-тРНК. Это связывание облегчается фактором удлинения Tu (EF-Tu), небольшим GTPазой. Для быстрого и точного распознавания соответствующей тРНК рибосома использует значительные конформационные изменения (конформационный контроль). Теперь P-сайт содержит начало пептидной цепи кодируемого белка, а A-сайт содержит следующую аминокислоту, которую необходимо добавить к пептидной цепи. Растущий полипептид, связанный с тРНК в P-сайте, отсоединяется от тРНК в P-сайте, и между последней аминокислотой полипептида и аминокислотой, все еще присоединенной к тРНК в A-сайте, образуется пептидная связь. Этот процесс, известный как образование пептидной связи, катализируется рибозимом (23S рибосомальная РНК в 50S рибосомальной субъединице). Теперь A-сайт содержит новообразованный пептид, а P-сайт – незаряженную тРНК (тРНК без аминокислоты). Новообразованный пептид в тРНК A-сайта известен как дипептид, а вся сборка называется дипептидил-тРНК. Известно, что тРНК в P-сайте, лишенная аминокислоты, деацилирована. На заключительной стадии удлинения, называемой транслокацией, деацилированная тРНК (в P-сайте) и дипептидил-тРНК (в A-сайте) вместе с соответствующими кодонами перемещаются соответственно в E- и P-сайты, а новый кодон входит в A-сайт. Этот процесс катализируется фактором удлинения G (EF-G). Деацилированная тРНК в E-сайте высвобождается из рибосомы во время следующей оккупации A-сайта аминоацил-тРНК, что также облегчается EF-Tu. Рибосома продолжает транслировать оставшиеся кодоны на мРНК, пока больше аминоацил-тРНК связываются с A-сайтом, пока рибосома не достигнет стоп-кодона на мРНК (UAA, UGA или UAG). Трансляционный аппарат работает относительно медленно по сравнению с ферментными системами, которые катализируют репликацию ДНК. Белки у бактерий синтезируются со скоростью всего 18 аминокислотных остатков в секунду, в то время как бактериальные реплисомы синтезируют ДНК со скоростью 1000 нуклеотидов в секунду. Эта разница в скорости отражает, отчасти, разницу между полимеризацией четырех типов нуклеотидов для получения нуклеиновых кислот и полимеризацией 20 типов аминокислот для получения белков. Проверка и отторжение неправильных молекул аминоацил-тРНК требует времени и замедляет синтез белка. У бактерий инициирование трансляции происходит сразу после синтеза 5'-конца мРНК, и трансляция и транскрипция сопряжены. Это невозможно у эукариот, поскольку транскрипция и трансляция осуществляются в отдельных компартментах клетки (ядро и цитоплазма).

Elongation of the polypeptide chain involves addition of amino acids to the carboxyl end of the growing chain. The growing protein exits the ribosome through the polypeptide exit tunnel in the large subunit. Elongation starts when the fMet tRNA enters the P site, causing a conformational change which opens the A site for the new aminoacyl tRNA to bind. This binding is facilitated by elongation factor Tu (EF Tu), a small GTPase. For fast and accurate recognition of the appropriate tRNA, the ribosome utilizes large conformational changes (conformational proofreading). Now the P site contains the beginning of the peptide chain of the protein to be encoded and the A site has the next amino acid to be added to the peptide chain. The growing polypeptide connected to the tRNA in the P site is detached from the tRNA in the P site and a peptide bond is formed between the last amino acids of the polypeptide and the amino acid still attached to the tRNA in the A site. This process, known as peptide bond formation, is catalyzed by a ribozyme (the 23S ribosomal RNA in the 50S ribosomal subunit). Now, the A site has the newly formed peptide, while the P site has an uncharged tRNA (tRNA with no amino acids). The newly formed peptide in the A site tRNA is known as dipeptide and the whole assembly is called dipeptidyl tRNA. The tRNA in the P site minus the amino acid is known to be deacylated. In the final stage of elongation, called translocation, the deacylated tRNA (in the P site) and the dipeptidyl tRNA (in the A site) along with its corresponding codons move to the E and P sites, respectively, and a new codon moves into the A site. This process is catalyzed by elongation factor G (EF G). The deacylated tRNA at the E site is released from the ribosome during the next A site occupation by an aminoacyl tRNA again facilitated by EF Tu. The ribosome continues to translate the remaining codons on the mRNA as more aminoacyl tRNA bind to the A site, until the ribosome reaches a stop codon on mRNA(UAA, UGA, or UAG). The translation machinery works relatively slowly compared to the enzyme systems that catalyze DNA replication. Proteins in bacteria are synthesized at a rate of only 18 amino acid residues per second, whereas bacterial replisomes synthesize DNA at a rate of 1000 nucleotides per second. This difference in rate reflects, in part, the difference between polymerizing four types of nucleotides to make nucleic acids and polymerizing 20 types of amino acids to make proteins. Testing and rejecting incorrect aminoacyl tRNA molecules takes time and slows protein synthesis. In bacteria, translation initiation occurs as soon as the 5' end of an mRNA is synthesized, and translation and transcription are coupled. This is not possible in eukaryotes because transcription and translation are carried out in separate compartments of the cell (the nucleus and cytoplasm).

Переработка

Послетерминационный комплекс, образованный в конце этапа терминации, состоит из мРНК с кодоном терминации в A-сайте, незаряженной тРНК в P-сайте и интактной 70S рибосомы. Этап рециклинга рибосомы отвечает за распад послетерминационного рибосомального комплекса. После высвобождения нового белка на этапе терминации, фактор рециклинга рибосом и фактор удлинения G (EF-G) способствуют высвобождению мРНК и тРНК из рибосомы и диссоциации 70S рибосомы на 30S и 50S субъединицы. Затем IF3 замещает деацилированную тРНК, высвобождая мРНК. Все компоненты трансляции теперь свободны для новых раундов трансляции. В зависимости от тРНК, IF1–IF3 также могут участвовать в рециклинге.

Полисомы

Перевод осуществляется более чем одной рибосомой одновременно. Из-за относительно большого размера рибосом они могут присоединяться только к участкам на мРНК, отстоящим друг от друга на 35 нуклеотидов. Комплекс одной мРНК и множества рибосом называется полисомой или полирибосомой.

Правила перевода

Когда бактериальные клетки исчерпывают питательные вещества, они переходят в стационарную фазу и снижают синтез белка. Несколько процессов опосредуют этот переход. Например, в E. coli рибосомы 70S образуют димеры 90S при связывании с небольшим белком 6,5 кДа – фактором модуляции рибосом RMF. Эти промежуточные рибосомные димеры впоследствии могут связывать молекулу фактора, способствующего переходу в состояние покоя (белок 10,8 кДа, HPF), для образования зрелой 100S рибосомной частицы, в которой интерфейс димеризации образован двумя 30S субъединицами двух участвующих рибосом. Димеры рибосом представляют собой состояние покоя и трансляционно неактивны. Третий белок, способный связываться с рибосомами при переходе клеток E. coli в стационарную фазу, – YfiA (ранее известный как RaiA). HPF и YfiA структурно схожи, и оба белка могут связываться с каталитическими A и P сайтами рибосомы. RMF блокирует связывание рибосомы с мРНК, предотвращая взаимодействие мессенджера с 16S рРНК. При связывании с рибосомами, C-концевой хвост YfiA из E. coli препятствует связыванию RMF, тем самым предотвращая димеризацию и приводя к образованию трансляционно неактивных мономерных рибосом 70S. [[Файл:RsfS mechanism. png|thumb|Механизм диссоциации рибосомных субъединиц посредством RsfS (= RsfA). RsfS инактивирует трансляцию, когда клетки испытывают дефицит питательных веществ ("S") и, следовательно, аминокислот. RsfS связывается с L14, белком большой рибосомальной субъединицы, и тем самым блокирует соединение малой субъединицы для формирования функциональной рибосомы 70S, замедляя или полностью блокируя трансляцию. Белки RsfS встречаются почти во всех эубактериях (но не в археях), а гомологи присутствуют в митохондриях и хлоропластах (где они называются C7orf30 и iojap соответственно). Однако механизм регуляции экспрессии или активности RsfS пока неизвестен. Другой фактор диссоциации рибосом в Escherichia coli – HflX, ранее GTPаза с неизвестной функцией. Чжан и соавторы (2015) показали, что HflX является фактором расщепления рибосом, индуцированным тепловым шоком, способным диссоциировать как свободные, так и связанные с мРНК рибосомы. N-концевой эффекторный домен HflX связывается с пептидилтрансферазным центром аналогичным образом, как факторы высвобождения I класса, и вызывает значительные конформационные изменения в центральных межсубъединичных мостах, тем самым способствуя диссоциации субъединиц. Соответственно, потеря HflX приводит к увеличению числа заблокированных рибосом при тепловом шоке и, возможно, других стрессовых условиях.

When bacterial cells run out of nutrients, they enter stationary phase and downregulate protein synthesis. Several processes mediate this transition. For instance, in E. coli, 70S ribosomes form 90S dimers upon binding with a small 6.5 kDa protein, ribosome modulation factor RMF. These intermediate ribosome dimers can subsequently bind a hibernation promotion factor (the 10.8 kDa protein, HPF) molecule to form a mature 100S ribosomal particle, in which the dimerization interface is made by the two 30S subunits of the two participating ribosomes. The ribosome dimers represent a hibernation state and are translationally inactive. A third protein that can bind to ribosomes when E. coli cells enter the stationary phase is YfiA (previously known as RaiA). HPF and YfiA are structurally similar, and both proteins can bind to the catalytic A and P sites of the ribosome. RMF blocks ribosome binding to mRNA by preventing interaction of the messenger with 16S rRNA. When bound to the ribosomes the C terminal tail of E. coli YfiA interferes with the binding of RMF, thus preventing dimerization and resulting in the formation of translationally inactive monomeric 70S ribosomes. [[File:RsfS mechanism. png|thumb|Mechanism of ribosomal subunit dissociation by RsfS (= RsfA). RsfS inactivates translation when cells starve ("S") and thus are short on amino acids. RsfS binds to L14, a protein of the large ribosomal subunit, and thereby blocks joining of the small subunit to form a functional 70S ribosome, slowing down or blocking translation entirely. RsfS proteins are found in almost all eubacteria (but not archaea) and homologs are present in mitochondria and chloroplasts (where they are called C7orf30 and iojap, respectively). However, it is not known yet how the expression or activity of RsfS is regulated. Another ribosome dissociation factor in Escherichia coli is HflX, previously a GTPase of unknown function. Zhang et al. (2015) showed that HflX is a heat shock–induced ribosome splitting factor capable of dissociating vacant as well as mRNA associated ribosomes. The N terminal effector domain of HflX binds to the peptidyl transferase center in a strikingly similar manner as that of the class I release factors and induces dramatic conformational changes in central intersubunit bridges, thus promoting subunit dissociation. Accordingly, loss of HflX results in an increase in stalled ribosomes upon heat shock and possibly other stress conditions.

Эффект антибиотиков

Несколько антибиотиков оказывают свое действие, воздействуя на процесс трансляции у бактерий. Они используют различия между прокариотической и эукариотической системами трансляции для избирательного подавления синтеза белка в бактериях, не затрагивая клетки хозяина.