Удаление мРНК с преждевременными стоп-кодонами у эукариот.

Введение

Устранение мРНК с преждевременными стоп-кодонами у эукариот

Нелепый опосредованный распад мРНК (NMD) — это система контроля качества, существующая во всех эукариотах. Её основная функция — снижение числа ошибок в экспрессии генов путём элиминации мРНК-транскриптов, содержащих преждевременные стоп-кодоны. Трансляция этих аберрантных мРНК в некоторых случаях может приводить к вредному усилению функции или доминантно-негативной активности результирующих белков. NMD был впервые описан в клетках человека и дрожжей почти одновременно в 1979 году, что указывает на широкую филогенетическую консервацию и важную биологическую роль этого интересного механизма. Открытие NMD произошло, когда стало понятно, что клетки часто содержат неожиданно низкие концентрации мРНК, транскрибируемых из аллелей, несущих нонсенс-мутации. Нонсенс-мутации кодируют преждевременный стоп-кодон, что приводит к укорочению белка. Усечённый белок может быть функциональным или нефункциональным, в зависимости от степени непереведённой части. В медицинской генетике NMD может не только ограничивать трансляцию аномальных белков, но и иногда вызывать неблагоприятные последствия при определённых генетических мутациях. NMD регулирует множество биологических функций в разнообразных клетках, включая синаптическую пластичность нейронов, которая может формировать поведение взрослых особей.

Путь

Хотя многие из белков, участвующих в NMD, не консервированы между видами, в *Saccharomyces cerevisiae* (дрожжах) есть три основных фактора в NMD: UPF1, UPF2 и UPF3 (UPF3A и UPF3B у людей), которые составляют консервированное ядро пути NMD. Все три этих фактора являются *транс*-действующими элементами, называемыми белками сдвига рамки считывания (UPF). У млекопитающих UPF2 и UPF3 являются частью комплекса экзон-экзонных стыков (EJC), связанных с мРНК после сплайсинга вместе с другими белками, eIF4AIII, MLN51 и гетеродимером Y14/MAGOH, которые также функционируют в NMD. Фосфорилирование UPF1 контролируется белками SMG1, SMG5, SMG6 и SMG7. Процесс обнаружения аберрантных транскриптов происходит во время трансляции мРНК. Популярная модель обнаружения аберрантных транскриптов у млекопитающих предполагает, что во время первого раунда трансляции рибосома удаляет комплексы экзон-экзонных стыков, связанных с мРНК после сплайсинга. Если после первого раунда трансляции какой-либо из этих белков остается связанным с мРНК, активируется NMD. Комплексы экзон-экзонных стыков, расположенные ниже стоп-кодона, не удаляются из транскрипта, поскольку рибосома высвобождается до их достижения. Окончание трансляции приводит к сборке комплекса, состоящего из UPF1, SMG1 и факторов высвобождения eRF1 и eRF3, на мРНК. Если на мРНК остается EJC, потому что транскрипт содержит преждевременный стоп-кодон, то UPF1 вступает в контакт с UPF2 и UPF3, вызывая фосфорилирование UPF1. У позвоночных расположение последнего комплекса экзон-экзонных стыков относительно стоп-кодона обычно определяет, будет ли транскрипт подвергнут NMD или нет. Если стоп-кодон находится ниже по течению или в пределах примерно 50 нуклеотидов от последнего комплекса экзон-экзонных стыков, то транскрипт транслируется нормально. Однако, если стоп-кодон находится дальше, чем примерно 50 нуклеотидов выше по течению от любых комплексов экзон-экзонных стыков, то транскрипт подвергается регуляции вниз NMD. Затем фосфорилированный UPF1 взаимодействует с SMG5, SMG6 и SMG7, которые способствуют дефосфорилированию UPF1. Считается, что SMG7 является терминальным эффектором в NMD, поскольку он накапливается в P-телах, которые являются цитоплазматическими участками распада мРНК. Как в дрожжах, так и в клетках человека основной путь распада мРНК инициируется удалением 5'-кэпа, за которым следует деградация экзорибонуклеазой XRN1. Другой путь, по которому разлагается мРНК, – это деаденилирование с 3'-конца. Помимо хорошо известной роли NMD в удалении аберрантных транскриптов, существуют транскрипты, содержащие интроны в своих 3'-UTR. Эти мРНК предположительно являются мишенями NMD, но они (например, белок, связанный с цитоскелетом и регулируемый активностью, известный как Arc) могут выполнять важные биологические функции, что позволяет предположить, что NMD может играть физиологически значимые роли. Человек, несущий только один пораженный аллель, будет иметь отсутствие или крайне низкий уровень мутантной β-глобиновой мРНК. Может возникнуть еще более тяжелая форма заболевания, называемая талассемией интермедиа или талассемией с телами включений. Вместо снижения уровня мРНК мутантный транскрипт производит укороченные β-цепи, что, в свою очередь, приводит к клиническому фенотипу у гетерозиготы. В статье, опубликованной в British Association of Dermatologists в 2012 году, "Отсутствие фенотипа рыжих волос у тучного ребенка из Северной Африки, гомозиготного по новой нулевой мутации POMC", была показана оценка РНК-распада, опосредованного преждевременным стоп-кодоном, в химическом анализе пигмента волос. Было обнаружено, что инактивирующая мутация гена *POMC* приводит к ожирению, недостаточности надпочечников и рыжим волосам. Это наблюдалось как у людей, так и у мышей. В этом эксперименте описывался 3-летний мальчик из Рима, Италия. Он привлек внимание, поскольку страдал болезнью Аддисона и ранним ожирением. У него собрали ДНК и амплифицировали ее с помощью ПЦР. Анализ секвенирования выявил гомозиготную однонуклеотидную замену, определяющую стоп-кодон. Это вызвало аберрантный белок, и соответствующая аминокислотная последовательность указала точное положение гомозиготного нуклеотида. Замена была локализована в экзоне 3 и представляла собой бессмысленную мутацию в кодоне 68. Результаты этого эксперимента убедительно свидетельствуют о том, что отсутствие рыжих волос у пациентов неевропейской расы с ранним ожирением и гормональной недостаточностью не исключает возможность мутаций *POMC*. В ходе этого геномного исследования ученые обнаружили, что аутосомные гены с большей вероятностью подвергаются РНК-распад, опосредованному преждевременным стоп-кодоном, чем гены, сцепленные с X-хромосомой. Это связано с тем, что NMD тонко регулирует X-хромосомы, что было продемонстрировано путем ингибирования этого пути. Результаты показали, что сбалансированная экспрессия генов между X-хромосомой и аутосомами снижалась на 10–15%, независимо от метода ингибирования. Путь NMD склоняется к подавлению экспрессии более многочисленных или аутосомных генов, чем генов, сцепленных с X-хромосомой. В заключение, данные подтверждают представление о том, что сочетание альтернативного сплайсинга и NMD является распространенным механизмом регуляции экспрессии генов.

While many of the proteins involved in NMD are not conserved between species, in Saccharomyces cerevisiae (yeast), there are three main factors in NMD: UPF1, UPF2 and UPF3 (UPF3A and UPF3B in humans), that make up the conserved core of the NMD pathway. All three of these factors are trans acting elements called up frameshift (UPF) proteins. In mammals, UPF2 and UPF3 are part of the exon exon junction complex (EJC) bound to mRNA after splicing along with other proteins, eIF4AIII, MLN51, and the Y14/MAGOH heterodimer, which also function in NMD. UPF1 phosphorylation is controlled by the proteins SMG 1, SMG 5, SMG 6 and SMG 7. The process of detecting aberrant transcripts occurs during translation of the mRNA. A popular model for the detection of aberrant transcripts in mammals suggests that during the first round of translation, the ribosome removes the exon exon junction complexes bound to the mRNA after splicing occurs. If after this first round of translation, any of these proteins remain bound to the mRNA, NMD is activated. Exon exon junction complexes located downstream of a stop codon are not removed from the transcript because the ribosome is released before reaching them. Termination of translation leads to the assembly of a complex composed of UPF1, SMG1 and the release factors, eRF1 and eRF3, on the mRNA. If an EJC is left on the mRNA because the transcript contains a premature stop codon, then UPF1 comes into contact with UPF2 and UPF3, triggering the phosphorylation of UPF1. In vertebrates, the location of the last exon junction complex relative to the termination codon usually determines whether the transcript will be subjected to NMD or not. If the termination codon is downstream of or within about 50 nucleotides of the final exon junction complex then the transcript is translated normally. However, if the termination codon is further than about 50 nucleotides upstream of any exon junction complexes, then the transcript is down regulated by NMD. The phosphorylated UPF1 then interacts with SMG 5, SMG 6 and SMG 7, which promote the dephosphorylation of UPF1. SMG 7 is thought to be the terminating effector in NMD, as it accumulates in P bodies, which are cytoplasmic sites for mRNA decay. In both yeast and human cells, the major pathway for mRNA decay is initiated by the removal of the 5’ cap followed by degradation by XRN1, an exoribonuclease enzyme. The other pathway by which mRNA is degraded is by deadenylation from 3’ 5'. In addition to the well recognized role of NMD in removing aberrant transcripts, there are transcripts that contain introns within their 3'UTRs. These messages are predicted to be NMD targets yet they (e. g., activity regulated cytoskeleton associated protein, known as Arc) can play crucial biologic functions suggesting that NMD may have physiologically relevant roles. An individual carrying only one affected allele will have no or extremely low levels of the mutant β globin mRNA. An even more severe form of the disease can occur called thalassemia intermedia or ‘inclusion body’ thalassemia. Instead of decreased mRNA levels, a mutant transcript produces truncated β chains, which in turn leads to a clinical phenotype in the heterozygote. Published in the British Associations of Dermatologists in 2012, Lack of red hair phenotype in a North African obese child homozygous for a novel POMC null mutation showed nonsense mediated decay RNA evaluation in a hair pigment chemical analysis. They found that inactivating the POMC gene mutation results in obesity, adrenal insufficiency, and red hair. This has been seen in both in humans and mice. In this experiment they described a 3 year old boy from Rome, Italy. He was a source of focus because he had Addison's disease and early onset obesity. They collected his DNA and amplified it using PCR. Sequencing analysis revealed a homozygous single substitution determining a stop codon. This caused an aberrant protein and the corresponding amino acid sequence indicated the exact position of the homozygous nucleotide. The substitution was localized in exon 3 and nonsense mutation at codon 68. The results from this experiment strongly suggest that the absence of red hair in non European patients with early onset obesity and hormone deficiency does not exclude the occurrence of POMC mutations. In this genome wide survey, the scientists found that autosomal genes are more likely to undergo nonsense mediated decay than X linked genes. This is because NMD fine tunes X chromosomes and it was demonstrated by inhibiting the pathway. The results were that balanced gene expression between X and autosomes gene expression was decreased by 10–15% no matter the method of inhibition. The NMD pathway is skewed towards depressing expression of larger population or autosomal genes than x linked ones. In conclusion, the data supports the view that the coupling of alternative splicing and NMD is a pervasive means of gene expression regulation.