Bovine pancreatic ribonuclease

Введение

Боровая панкреатическая рибонуклеаза, также часто называемая боровая панкреатическая рибонуклеаза А или просто RNase A, является панкреатическим рибонуклеазно-ферментом, который расщепляет одноцепочечную РНК. Бовинская панкреатическая рибонуклеаза является одной из классических модельных систем белковой науки. Две Нобелевские премии по химии были присуждены в знак признания работы над панкреатической рибонуклеазой крупного рогатого скота: в 1972 году премия была присуждена Кристиану Анфинсену за его работу над сгибанием белка и Стэнфорду Муру и Уильяму Стейну за их работу над связью между структурой белка и его химическим механизмом; в 1984 году премия была присуждена Роберту Брюсу Меррифильду за разработку химического синтеза белков.

История

Бовинская панкреатическая рибонуклеаза стала общей моделью в исследовании белков, в основном потому, что она была чрезвычайно стабильной и могла быть очищена в больших количествах. В 1940-х годах Armour and Company очистили килограмм белка в очень большом количестве, особенно по стандартам очистки белка того времени, и предложили образцы по низкой цене заинтересованным ученым. Возможность иметь одну партию очищенного фермента сделала его преобладающей моделью для исследований белков. Он остается обычно называемым рибонуклеазой А или РНАзой А как наиболее заметным членом его семейства белков, известным как панкреатическая рибонуклеаза, рибонуклеаза А или рибонуклеаза I. Исследования Кристиана Анфинсена о процессе окислительного сгибания панкреатической рибонуклеазы говядины заложили основу для понимания связи между последовательностью аминокислот и сгибаемой трехмерной структурой белка и укрепили термодинамическую гипотезу сгибания белка, согласно которой сгибаемая форма белка представляет его минимальную свободную энергию. РНАза А была первым ферментом, для которого был предложен правильный каталитический механизм, даже до того, как была известна его структура. RNase A был первым белком, который показал влияние неродных изомеров пептидных связей, предшествующих остаткам пролина в сгибании белка. Бовиновая панкреатическая рибонуклеаза также была модельным белком, используемым для разработки многих спектроскопических методов для анализа структуры белка, включая абсорбцию, круговой дихроизм, Раман, электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Это был первый модельный белок для разработки химических методов изучения белков, таких как химическая модификация открытых боковых цепей, антигенное распознавание и ограниченный протеолиз нарушенных сегментов. Рибонуклеаза S, которая является RNase A, которая была обработана протеазой субтилизином, была третьим белком, кристаллографическая структура которого была решена в 1967 году.

Структура и свойства

RNase A - относительно небольшой белок (124 остатка, ~ 13,7 кДа). Его можно охарактеризовать как двухслойный белок с глубокой щелей для связывания РНК-субстрата. Первый слой состоит из трех альфа-вертков (остаток 3 13, 24 34 и 50 60) от N-концевой половины белка. Второй слой состоит из трех β-шпинок (остатков 61 74, 79 104 и 105 124 от конечной половины C), расположенных в двух β-листах. Штыки 61 74 и 105 124 образуют четырехцепочечный, антипараллельный β-лист, который лежит на спирали 3 (остатки 50 60). Самый длинный β-шпион 79 104 спаривается с короткой β-цепочкой (остатки 42 45) для образования трехцепочечного, антипараллельного β-листа, который лежит на спирали 2 (остатки 24 34). RNase A имеет четыре дисульфидные связи в своем естественном состоянии: Cys26 Cys84, Cys58 110, Cys40 95 и Cys65 72. Первые два (26 84 и 58 110) необходимы для конформационного сгиба; каждый соединяет альфа-спираль первого слоя с бета-листом второго слоя, образуя небольшое гидрофобное ядро в его окрестностях. Последние две дисульфидные связи (40 95 и 65 72) менее важны для сгиба; любая из них может быть уменьшена (но не обе) без воздействия на родную структуру в физиологических условиях. Эти дисульфидные связи соединяют сегменты петли и относительно подвержены воздействию растворителя. Дисульфидная связь 65 72 имеет чрезвычайно высокую склонность к образованию, значительно больше, чем можно было бы ожидать от энтропии ее петли, как в качестве пептида, так и в полном протеине. Это говорит о том, что шнурка 61 74 β имеет высокую склонность к конформационному сгибанию. RNase A является основным белком (pI = 9,63); его многочисленные положительные заряды согласуются с его связыванием с РНК (полианион). Более общая, RNase A необычно полярная или, скорее, необычно отсутствует в гидрофобных группах, особенно в алифатических. Это может объяснить необходимость четырех дисульфидных связей для стабилизации структуры. Низкое гидрофобное содержание может также служить для уменьшения физического отталкивания между высоко заряженными группами (своей собственной и РНК-субстрата) и областями низкой диэлектрической константы (неполярные остатки). Н-концевая α-спираль RNase A (остатки 3 13) соединена с остальной частью RNase A гибким линкером (остатки 16 23). Как показал Ф. М. Ричардс, этот линкер может быть расщеплен субтилизином между остатками 20 и 21 без вызова дисоции N-концевой спирали от остальной части RNase A. Пептидный белковый комплекс называется "RNase S", пептид (остатки 1 20) называется "S пептид", а остаток (остатки 21 124) называется "S белком". Константа диссоциации пептида S для белка S составляет примерно 30 pM; это тесное связывание может быть использовано для очистки белка путем присоединения пептида S к протеину, представляющему интерес, и пропускания смеси через колонку аффинности с связанным белком S. [Меньший пептид С (остатки 1 13) также работает.] Система модели RNase S также использовалась для изучения сгибания белка путем сцепления сгибания и ассоциации. Пептид S был первым пептидом из родного белка, у которого была (блегчащая) вторичная структура в изоляции (Klee и Brown в 1967 году). РНАза А расщепляется специально после пиримидиновых нуклеотидов. Расщепление происходит в два этапа: во-первых, 3,5 фосфодиэстерная связь расщепляется для получения 2,3 циклического фосфодиэстерного промежуточного продукта; во-вторых, циклический фосфодиэстер гидролизуется до 3 монофосфата. Он может быть ингибирован белком- ингибитором рибонуклеазы, ионами тяжелых металлов и комплексами ванадата уридина.

RNase A is a relatively small protein (124 residues, ~13.7 kDa). It can be characterized as a two layer protein with a deep cleft for binding the RNA substrate. The first layer is composed of three alpha helices (residues 3 13, 24 34 and 50 60) from the N terminal half of the protein. The second layer consist of three β hairpins (residues 61 74, 79 104 and 105 124 from the C terminal half) arranged in two β sheets. The hairpins 61 74 and 105 124 form a four stranded, antiparallel β sheet that lies on helix 3 (residues 50 60). The longest β hairpin 79 104 mates with a short β strand (residues 42 45) to form a three stranded, antiparallel β sheet that lies on helix 2 (residues 24 34). RNase A has four disulfide bonds in its native state: Cys26 Cys84, Cys58 110, Cys40 95 and Cys65 72. The first two (26 84 and 58 110) are essential for conformational folding; each joins an alpha helix of the first layer to a beta sheet of the second layer, forming a small hydrophobic core in its vicinity. The latter two disulfide bonds (40 95 and 65 72) are less essential for folding; either one can be reduced (but not both) without affecting the native structure under physiological conditions. These disulfide bonds connect loop segments and are relatively exposed to solvent. The 65 72 disulfide bond has an extraordinarily high propensity to form, significantly more than would be expected from its loop entropy, both as a peptide and in the full length protein. This suggests that the 61 74 β hairpin has a high propensity to fold conformationally. RNase A is a basic protein (pI = 9.63); its many positive charges are consistent with its binding to RNA (a poly anion). More generally, RNase A is unusually polar or, rather, unusually lacking in hydrophobic groups, especially aliphatic ones. This may account for its need of four disulfide bonds to stabilize its structure. The low hydrophobic content may also serve to reduce the physical repulsion between highly charged groups (its own and those of its substrate RNA) and regions of low dielectric constant (the nonpolar residues). The N terminal α helix of RNase A (residues 3 13) is connected to the rest of RNase A by a flexible linker (residues 16 23). As shown by F. M. Richards, this linker may be cleaved by subtilisin between residues 20 and 21 without causing the N terminal helix to dissociate from the rest of RNase A. The peptide protein complex is called "RNase S", the peptide (residues 1 20) is called the "S peptide" and the remainder (residues 21 124) is called the "S protein". The dissociation constant of the S peptide for the S protein is roughly 30 pM; this tight binding can be exploited for protein purification by attaching the S peptide to the protein of interest and passing a mixture over an affinity column with bound S protein. [A smaller C peptide (residues 1 13) also works.] The RNase S model system has also been used for studying protein folding by coupling folding and association. The S peptide was the first peptide from a native protein shown to have (flickering) secondary structure in isolation (by Klee and Brown in 1967). RNase A cleaves specifically after pyrimidine nucleotides. Cleavage takes place in two steps: first, the 3’,5’ phosphodiester bond is cleaved to generate a 2’,3’ cyclic phosphodiester intermediate; second, the cyclic phosphodiester is hydrolyzed to a 3’ monophosphate. It can be inhibited by ribonuclease inhibitor protein, by heavy metal ions, and by uridine vanadate complexes.