Введение

Научный анализ

Испытания токсичности in vitro – это научный анализ токсического воздействия химических веществ на культивированные бактерии или клетки млекопитающих. Методы тестирования in vitro (дословно «в стекле») используются прежде всего для выявления потенциально опасных химических веществ и/или подтверждения отсутствия определенных токсических свойств на ранних этапах разработки потенциально полезных новых веществ, таких как лекарственные препараты, агрохимикаты и пищевые добавки. Ключевые государственные учреждения (например, EPA, NIEHS/NTP, FDA) в последнее время уделяют особое внимание анализу токсичности ксенобиотиков in vitro для более точной оценки рисков для здоровья человека. Ведутся активные работы по использованию систем in vitro для углубленного изучения механизмов токсического действия и применению клеток и тканей человека для определения токсических эффектов, специфичных для человека.

Улучшение по сравнению с испытаниями на животных

Большинство токсикологов считают, что методы тестирования токсичности in vitro могут быть более полезными, экономичными и занимать меньше времени, чем токсикологические исследования на живых животных (которые называются методами in vivo или методами "in life"). Однако экстраполяция результатов, полученных in vitro, к in vivo требует осторожного подхода и является активной областью исследований. В связи с нормативными ограничениями и этическими соображениями, поиск альтернатив тестированию на животных получил новый импульс. Во многих случаях тесты in vitro предпочтительнее тестов на животных, поскольку их можно использовать для разработки более безопасных продуктов. Агентство по охране окружающей среды США изучило 1065 химических и лекарственных веществ в рамках программы ToxCast (часть информационной панели CompTox Chemicals Dashboard), используя моделирование in silico и анализ на основе человеческих плюрипотентных стволовых клеток для прогнозирования развития токсичности in vivo, основываясь на изменениях клеточного метаболизма после воздействия химических веществ. Основные результаты анализа этого набора данных ToxCast STM, опубликованные в 2020 году, включают: (1) 19% из 1065 химических веществ показали прогноз развития токсичности, (2) точность анализа составила 79–82% при высокой специфичности (> 84%), но умеренной чувствительности (< 67%) по сравнению с моделями развития токсичности для человека в период беременности на животных in vivo, (3) чувствительность повысилась при применении более строгих критериев оценки доказательств в исследованиях на животных, и (4) статистический анализ наиболее сильных химических воздействий на конкретные биохимические мишени в ToxCast выявил положительные и отрицательные корреляции с ответом STM, что позволило получить представление о механизмах, лежащих в основе исследуемой конечной точки и ее биологической области.

Примеры анализа жизнеспособности клеток и других анализов цитотоксичности, используемых для токсикологии in vitro

Существует множество методов анализа для оценки цитотоксичности и других клеточных ответов тестируемых веществ.

Анализ гемолиза

Анализ на гемолиз определяет способность химических веществ, лекарственных препаратов или медицинских изделий и материалов, контактирующих с кровью, вызывать разрушение эритроцитов (красных кровяных клеток). Разрушение клеток легко обнаруживается по высвобождаемому гемоглобину.

МТТ и МТС

Метод MTT часто используется для определения жизнеспособности клеток и был подтвержден для использования международными организациями. Анализ MTT включает в себя два этапа: добавление реагента к химическим веществам и последующий этап растворения. Колориметрический in vitro анализ MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий) является усовершенствованной версией валидированного метода MTT, при этом анализ MTS обладает преимуществом в виде растворимости. Следовательно, этап растворения не требуется.

Нейтральный красный

Другим показателем жизнеспособности клеток может быть поглощение нейтрального красного (NR). Нейтральный красный, слабока́тионный краситель, проникает через клеточные мембраны недиффузионным путем и накапливается внутриклеточно в лизосомах. Жизнеспособные клетки поглощают краситель NR, а поврежденные или мертвые клетки – нет.

Количественное определение цитокинов с помощью ЭЛИСА

Наборы ELISA можно использовать для изучения повышения и снижения уровня провоспалительных медиаторов, таких как цитокины (IL-1, TNF-альфа, PGE2).

Измерение подобных клеточных реакций позволяет оценить взаимодействие исследуемого вещества с используемыми моделями (монослойные клеточные культуры, трехмерные модели тканей, тканевые экспланты).

Виды исследований in vitro

В целом, существует два основных типа исследований in vitro, различающихся по типу используемой системы для проведения эксперимента. Обычно применяются следующие типы систем: а) статическая система планшетных лунок и б) многокамерные системы с перфузией.

Система статических колодцевых пластин

Системы статических планшетов или слоев – наиболее традиционная и простая форма анализов, широко используемых для исследований in vitro. Эти анализы весьма полезны благодаря своей простоте и доступной среде для мониторинга химических веществ как в культуральной среде, так и внутри клеток. Однако недостатком использования этих простых статических планшетных анализов является то, что они не способны воспроизвести клеточные взаимодействия и физиологический поток жидкости, происходящие в организме.

Многокомпонентные перфузионные системы

В настоящее время разрабатываются новые платформы для тестирования, предназначенные для решения проблем, связанных с клеточными взаимодействиями. Эти новые платформы значительно сложнее и основаны на многокамерных перфузионных системах. Основная цель этих систем – более достоверно воспроизводить механизмы, происходящие in vivo, обеспечивая среду для культивирования клеток, максимально приближенную к физиологическим условиям. Каждая камера в системе представляет собой определенный орган живого организма и, следовательно, обладает специфическими характеристиками и критериями. Камеры в этих системах соединены трубками и насосами, по которым циркулирует жидкость, имитируя кровоток in vivo. Недостатком использования этих перфузионных систем является то, что неблагоприятные эффекты (влияние как биологических, так и небиологических компонентов системы на поведение исследуемого вещества) выражены сильнее, чем в статических системах. Для снижения влияния небиологических компонентов все камеры изготавливаются из стекла, а соединительные трубки – из тефлона. Для учета неспецифического связывания, происходящего в этих системах in vitro, предложен ряд кинетических моделей. Для преодоления биологических трудностей, связанных с использованием различных условий культивирования in vitro, необходимо модифицировать традиционные модели, применяемые в колбах или микропланшетах. Благодаря параллельному развитию микротехнологий и тканевой инженерии эти проблемы решаются с помощью новых эффективных инструментов, называемых "микрофлюидными биочипами".