Аспартат карбамоилтрансфераза: құрылымы, қасиеттері және аллостериялық реттелуі

Кіріспе

Ақуыз отбасы

Аспартат карбамоилтрансфераза (сондай-ақ аспартат транскарбамоилаза немесе ATCase деп те аталады) пиримидин биосинтез жолының бірінші қадамын катализдейді. E. coli-де фермент 12 кіші бірліктен (жалпы 300 кДа) тұратын көп кіші бірлікті ақуыз кешені болып табылады. Кіші бірліктердің құрамы C6R6, 2 тримерлі каталитикалық кіші бірліктерді (34 кДа) және 3 димерлі реттеуші кіші бірліктерді (17 кДа) құрайды. Осы ферменттегі каталитикалық және реттеуші кіші бірліктердің ерекше орналасуы кешенге оның субстраттарына қатысты күшті аллостериялық қасиеттер береді. Фермент метаболикалық ферменттік реакцияларды нақты бақылаудың аллостериялық модуляциясының классикалық мысалы болып табылады. ATCase Michaelis–Menten кинетикасына бағынбайды. Керісінше, ол төмен белсенділігі және төмен байланысу қабілеті бар "керілген" және жоғары белсенділігі және жоғары байланысу қабілеті бар "босаңсыған" күйлер арасында болады. Субстраттың каталитикалық кіші бірліктерге байланысуы тепе-теңдікті R күйіне қарай жылдырады, ал CTP-нің реттеуші кіші бірліктерге байланысуы тепе-теңдікті T күйіне қарай жылдырады. АТФ-ның реттеуші кіші бірліктерге байланысуы тепе-теңдікті R күйіне қарай жылдырады.

Реакция

АТКаза – пиримидин биосинтезіндегі бірінші, шешуші қадамды катализдейтін, яғни L-аспартат пен карбамоил фосфатының конденсациясы арқылы N-карбамоил-L-аспартат пен бейорганикалық фосфат түзілуін қамтамасыз ететін жоғары реттелетін фермент. ATCase катализі пиримидин биосинтезіндегі жылдамдық шектеуші қадам болып табылады, себебі ол жасушадағы пиримидиндер мен пуриндердің деңгейіне жауап ретінде каталитикалық жылдамдығын өзгертеді. Пиримидин жолының соңғы өнімі – CTP – каталитикалық жылдамдықты төмендетсе, ал параллель пурин жолының соңғы өнімі – ATP – каталитикалық жылдамдықты арттырады.

Құрылымы

Құрылымы, каталитикалық орталығы және аллостерикалық орны туралы талқылау АТК-ның прокариоттық нұсқасына, атап айтқанда, E. coli-ға негізделген. Алғашқы зерттеулер АТК екі түрлі, әр түрлі рөл атқаратын полипептидтік тізбектерден тұрады деп көрсетті. Каталитикалық кішібірліктер аспартат амин тобының карбамиляциясын катализдейді, бірақ реттеуші қасиеттерге ие емес, ал реттеуші кішібірліктер каталитикалық белсенділікке ие емес, бірақ эффекттормен байланысудың реттеуші орындарын қамтиды. ATCase голоферменті үш реттеуші димермен байланысқан және біріктірілген екі каталитикалық тримерден тұрады, сондықтан ферменттің табиғи түрінде әр түрдің алты тізбегі бар, жалпы молекулалық салмағы 310 кДа. Каталитикалық домендердің әрқайсысы екі құрылымдық доменнен тұрады: аспартат доменінде аспартатпен байланысу үшін жауапты қалдықтардың көпшілігі және карбамоил фосфатына байланысты қалдықтардың көпшілігі бар карбамоил фосфаты доменінде. Әрбір реттеуші домен екі доменнен тұрады: нуклеотидтік эффекттердің байланысу орны бар аллостеролық домен және C терминалды аймағында топталған төрт цистеин қалдықтарынан тұратын цинк домен. Бұл қалдықтар ешқандай каталитикалық қасиетке қатысы жоқ мырыш атомдарын үйлестіреді, бірақ реттеуші және каталитикалық кішібірліктердің бірлестігі үшін маңызды екені дәлелденді. Каталитикалық және реттеуші кішібірліктердің үш өлшемді орналасуы аминқышқылдары қалдықтарының арасындағы бірнеше иондық және гидрофобтық тұрақтандырушы байланыстарды қамтиды. Бұл қосылыс АТК-ның күшті ингибиторы болып табылады және оның құрылымы субстраттардың өтпелі күйіне өте жақын деп есептеледі. Сонымен қатар, карбамоилфосфат пен сукцинатқа байланған АТК-ның кристалдық құрылымдары алынды. Бұл зерттеулер, белгілі бір аминқышқылдарының сайтқа бағытталған мутагенезін қолдана отырып жүргізілген зерттеулерге қоса, катализ үшін маңызды бірнеше қалдықтарды анықтады, мысалы Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231, Ser80 және Lys84 көршілес каталитикалық тізбектен. Белсенді орын – жоғары оң зарядталған қалта. Ең маңызды бүйірлік тізбектердің бірі – Arg54, ол карбамоил фосфатының терминалды оттегісімен және сусыз оттегімен әрекеттесіп, фосфат тобының теріс зарядын тұрақтандырады. Arg105, His134 және Thr55 карбонил көміртегімен әрекеттесу арқылы карбонил көміртегінің электрофилділігін арттыруға көмектеседі. Бұл төртіншілік құрылымның өзгеруі ішкібірліктер мен домендер арасындағы өзара әрекеттесудің өзгеруімен байланысты. Бұл түрлендіру кезінде C1, C4 және R1 кішібірліктерінің өзара әрекеттесуі айтарлықтай өзгеріске ұшырайды. Әсіресе, 230–254 аминқышқылдары қалдықтарының үлкен қозғалысы бар, олар 240s цикл ретінде белгілі. Бұл қалдықтар карбамоил фосфаты мен аспартат домендерінің арасындағы C1 және C4 интерфейсіндегі жарылыста орналасқан. Бұл құрылымдық өзгерістердің жалпы нәтижесі – әр каталитикалық тізбектің екі доменінің бір-біріне жақындай түсуі, субстраттармен немесе олардың аналогтарымен жақсы байланыс орнату. Бұл құрылымдық ауысу кезінде бүйірлік тізбектер арасындағы кейбір өзара іс-қимыл жоғалады, ал басқалары құрылады. Зерттеулер 240s циклінің орналасуы тиісті белсенді сайттағы субстратты байланыстыруға тікелей әсер ететінін растады. 240s циклінің сайтқа бағытталған мутагенезін қолдана отырып жүргізілген алдыңғы зерттеулер Asp271 мен Tyr240 арасындағы және C1 Glu239 мен C4 Tyr165 арасындағы өзара әрекеттесулер T күйін тұрақтандыратынын, ал C1 Glu239 мен C4 Lys164 және Tyr165 арасындағы өзара әрекеттесулер R күйін тұрақтандыратынын көрсетті. 240s циклінің және белсенді орынның жанында орналасқан, 160–166 қалдықтарын қамтитын цикл аймағы ферменттің ішкі құрылымында да, оның реттеуші қасиеттерінде де рөл атқарады. Атап айтқанда, қалдық Asp162 Gln231 (аспартат байланысуына қатысы бар деп белгілі) -мен өзара әрекеттеседі және T және R күйінде бірдей қалдықтарды байлайды. Бұл қалдықты аланинге өзгерткен мутант ерекше белсенділіктің күрт төмендеуін, аспартатқа жанастықтың екі есе төмендеуін, гомотроптық кооперативтіліктің жоғалуын және АТФ-ның белсенділігінің төмендеуін көрсетті. Бұл қалдықтың енгізілуімен жалпы құрылымының өзгеруі R1 C1, R1 C4 және C1 C4 интерфейстеріндегі басқа қалдықтарға әсер етеді деп болжалды, олар төртіншілік құрылысқа ауысады.

The discussion of structure, catalytic center, and allosteric site that follows is based on the prokaryotic version of ATCase, specifically E. coli's. Early studies demonstrated that ATCase consists of two different kinds of polypeptide chains, which have different roles. The catalytic subunits catalyze the carbamylation of the amino group of aspartate but do not have regulatory properties, while the regulatory subunits do not have any catalytic activity but contain the regulatory sites for effector binding. The ATCase holoenzyme is made of two catalytic trimers that are in contact and held together by three regulatory dimers, so the native form of the enzyme contains six chains of each type, with a total molecular weight of 310 kDa. Each of the catalytic domains is composed of two structural domains, the aspartate domain, which contains most of the residues responsible for binding aspartate, and the carbamoyl phosphate domain, which contains most of the residues that bind to carbamoyl phosphate. Each regulatory domain is also composed of two domains, the allosteric domain, which has the binding site for the nucleotide effectors, and the zinc domain, consisting of four cysteine residues clustered in its C terminal region. These residues coordinate a zinc atom that is not involved in any catalytic property, but has been shown to be essential for the association of regulatory and catalytic subunits. The three dimensional arrangement of the catalytic and regulatory subunits involves several ionic and hydrophobic stabilizing contacts between amino acid residues. This compound is a strong inhibitor of ATCase and has a structure that is thought to be very close to that of the transition state of the substrates. Additionally, crystal structures of ATCase bound to carbamoylphosphate and succinate have been obtained. These studies, in addition to investigations using site directed mutagenesis of specific amino acids, have identified several residues that are crucial for catalysis, such as Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231, and Ser80 and Lys84 from an adjacent catalytic chain. The active site is a highly positively charged pocket. One of the most critical side chains is from Arg54, which interacts with a terminal oxygen and the anhydride oxygen of carbamoyl phosphate, stabilizing the negative charge of the leaving phosphate group. Arg105, His134, and Thr55 help to increase the electrophilicity of the carbonyl carbon by interacting with the carbonyl oxygen. This quaternary structure change is associated with alterations in inter subunit and inter domain interactions. The interaction between subunits C1 C4 and R1 is extensively modified during this conversion. In particular, there is large movement of amino acid residues 230–254, known collectively as the 240s loop. These residues are located at the cleft between the carbamoyl phosphate and aspartate domains at the C1 C4 interface. The overall outcome of these structural changes is that the two domains of each catalytic chain come closer together, ensuring a better contact with the substrates or their analogues. During this structural transition, some interactions between side chains are lost and some others are established. Studies have confirmed that the position of the 240s loop directly affects substrate binding in the corresponding active site. Earlier studies using site directed mutagenesis of the 240s loop showed that interactions between Asp271 and Tyr240, and between Glu239 of C1 and Tyr165 of C4 would stabilize the T state, while interactions between Glu239 of C1 and both Lys164 and Tyr165 of C4 would stabilize the R state. Located close to the 240s loop and the active site, the loop region encompassing residues 160–166 plays a role in both the internal architecture of the enzyme and its regulatory properties. In particular, the residue Asp162 interacts with Gln231 (known to be involved in aspartate binding), and binds the same residues in both the T and R states. A mutant that had this residue mutated to alanine showed a huge reduction in specific activity, a two fold decrease in the affinity for aspartate, a loss of homotropic cooperativity, and decreased activation by ATP. It was suggested that the change in the overall structure caused by the introduction of this residue affects other residues in the R1 C1, R1 C4 and C1 C4 interfaces, which are involved in the quaternary structure transition.

Кешенді құрастыру

Регуляторлық және каталитикалық кішібірліктер біріккен белок гомологтары түрінде кездеседі, бұл олардың бір-бірімен өзара әрекеттесетініне күшті дәлел келтіреді. Екі каталитикалық тример және екі реттеуші димер аспартат карбамоилтрансферазаның 6 каталитикалық және 4 реттеуші кішібірліктерден тұратын аралық түрін құрастырады.