Аспартаткарбамоилтрансфераза: структура, регуляция и аллостерия

Введение

Семья белков

Аспартат-карбамоилтрансфераза (также известная как аспартат-транскарбамоилаза или ATCase) катализирует первый этап пиримидинового биосинтетического пути. У *E. coli* фермент представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, состоящий из 12 субъединиц (общая молекулярная масса 300 кДа). Состав субъединиц – C6R6, формируя 2 тримера каталитических субъединиц (34 кДа) и 3 димера регуляторных субъединиц (17 кДа). Специфическое расположение каталитических и регуляторных субъединиц в этом ферменте обеспечивает комплексу выраженное аллостерическое поведение по отношению к его субстратам. Фермент является архетипическим примером аллостерической модуляции тонкой регуляции метаболических ферментативных реакций. ATCase не подчиняется кинетике Микаэлиса–Ментен. Вместо этого он находится в равновесии между состоянием низкой активности и низкого сродства ("напряженным") и состоянием высокой активности и высокого сродства ("расслабленным"). Связывание субстрата с каталитическими субъединицами вызывает сдвиг равновесия в сторону R-состояния, в то время как связывание ЦТФ с регуляторными субъединицами вызывает сдвиг равновесия в сторону T-состояния. Связывание АТФ с регуляторными субъединицами вызывает сдвиг равновесия в сторону R-состояния.

Реакция

ATCase — это высокорегулируемый фермент, который катализирует первый ключевой этап в биосинтезе пиримидинов — конденсацию L-аспартата и карбамоилфосфата с образованием N-карбамоил-L-аспартата и неорганического фосфата. Катализ, осуществляемый ATCase, является лимитирующей стадией в биосинтезе пиримидинов, поскольку он изменяет свою каталитическую активность в ответ на концентрацию пиримидинов и пуринов в клетке. Конечный продукт пиримидинового пути, CTP, снижает каталитическую активность, в то время как ATP, конечный продукт параллельного пуринового пути, повышает ее.

Структура

Обсуждение структуры, каталитического центра и аллостерического сайта, которое следует, основано на прокариотической версии ATCase, в частности, E. coli. Ранние исследования показали, что ATCase состоит из двух различных типов полипептидных цепей, выполняющих разные функции. Каталитические субъединицы катализируют карбамилирование аминогруппы аспартата, но не обладают регуляторными свойствами, в то время как регуляторные субъединицы не проявляют каталитической активности, но содержат регуляторные участки для связывания эффекторов. Голофермент ATCase состоит из двух каталитических тримеров, находящихся в контакте и соединенных тремя регуляторными димерами, поэтому нативная форма фермента содержит шесть цепей каждого типа с общей молекулярной массой 310 кДа. Каждая из каталитических доменов состоит из двух структурных доменов: аспартатного домена, содержащего большинство остатков, ответственных за связывание аспартата, и карбамоилфосфатного домена, содержащего большинство остатков, взаимодействующих с карбамоилфосфатом. Каждый регуляторный домен также состоит из двух доменов: аллостерического домена, имеющего сайт связывания нуклеотидных эффекторов, и цинкового домена, состоящего из четырех цистеиновых остатков, сгруппированных в его C-концевой области. Эти остатки координируют атом цинка, который не участвует в каталитических свойствах, но показан как необходимый для ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц. Трехмерное расположение каталитических и регуляторных субъединиц включает в себя несколько ионных и гидрофобных стабилизирующих контактов между аминокислотными остатками. Это соединение является сильным ингибитором ATCase и имеет структуру, предположительно очень близкую к структуре переходного состояния субстратов. Кроме того, получены кристаллические структуры ATCase, связанного с карбамоилфосфатом и сукцинатом. Эти исследования, в дополнение к исследованиям с использованием направленного мутагенеза специфических аминокислот, выявили несколько остатков, имеющих решающее значение для катализа, таких как Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231, Ser80 и Lys84 из смежной каталитической цепи. Активный центр – это высоко положительно заряженный карман. Одной из наиболее важных боковых цепей является цепь Arg54, которая взаимодействует с концевым и ангидридным кислородом карбамоилфосфата, стабилизируя отрицательный заряд уходящей фосфатной группы. Arg105, His134 и Thr55 помогают увеличить электрофильность карбонильного углерода, взаимодействуя с карбонильным кислородом. Это изменение четвертичной структуры связано с изменениями во взаимодействиях между субъединицами и доменами. Взаимодействие между субъединицами C1, C4 и R1 значительно изменяется во время этого преобразования. В частности, наблюдается значительное перемещение аминокислотных остатков 230–254, известных как петля 240s. Эти остатки расположены в расщелине между карбамоилфосфатным и аспартатным доменами на интерфейсе C1-C4. Общим результатом этих структурных изменений является сближение двух доменов каждой каталитической цепи, обеспечивающее лучший контакт с субстратами или их аналогами. Во время этого структурного перехода некоторые взаимодействия между боковыми цепями теряются, а другие устанавливаются. Исследования подтвердили, что положение петли 240s напрямую влияет на связывание субстрата в соответствующем активном центре. Предыдущие исследования с использованием направленного мутагенеза петли 240s показали, что взаимодействие между Asp271 и Tyr240, а также между Glu239 из C1 и Tyr165 из C4 стабилизирует состояние T, в то время как взаимодействие между Glu239 из C1 и Lys164 и Tyr165 из C4 стабилизирует состояние R. Расположенная вблизи петли 240s и активного центра, область петли, охватывающая остатки 160–166, играет роль как во внутренней архитектуре фермента, так и в его регуляторных свойствах. В частности, остаток Asp162 взаимодействует с Gln231 (известно, что он участвует в связывании аспартата) и связывает одни и те же остатки как в состоянии T, так и в состоянии R. Мутант, у которого этот остаток был мутирован в аланин, показал значительное снижение специфической активности, двукратное снижение аффинности к аспартату, потерю гомотропной кооперативности и снижение активации АТФ. Предполагается, что изменение общей структуры, вызванное введением этого остатка, влияет на другие остатки в интерфейсах R1-C1, R1-C4 и C1-C4, которые участвуют в переходе четвертичной структуры.

The discussion of structure, catalytic center, and allosteric site that follows is based on the prokaryotic version of ATCase, specifically E. coli's. Early studies demonstrated that ATCase consists of two different kinds of polypeptide chains, which have different roles. The catalytic subunits catalyze the carbamylation of the amino group of aspartate but do not have regulatory properties, while the regulatory subunits do not have any catalytic activity but contain the regulatory sites for effector binding. The ATCase holoenzyme is made of two catalytic trimers that are in contact and held together by three regulatory dimers, so the native form of the enzyme contains six chains of each type, with a total molecular weight of 310 kDa. Each of the catalytic domains is composed of two structural domains, the aspartate domain, which contains most of the residues responsible for binding aspartate, and the carbamoyl phosphate domain, which contains most of the residues that bind to carbamoyl phosphate. Each regulatory domain is also composed of two domains, the allosteric domain, which has the binding site for the nucleotide effectors, and the zinc domain, consisting of four cysteine residues clustered in its C terminal region. These residues coordinate a zinc atom that is not involved in any catalytic property, but has been shown to be essential for the association of regulatory and catalytic subunits. The three dimensional arrangement of the catalytic and regulatory subunits involves several ionic and hydrophobic stabilizing contacts between amino acid residues. This compound is a strong inhibitor of ATCase and has a structure that is thought to be very close to that of the transition state of the substrates. Additionally, crystal structures of ATCase bound to carbamoylphosphate and succinate have been obtained. These studies, in addition to investigations using site directed mutagenesis of specific amino acids, have identified several residues that are crucial for catalysis, such as Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231, and Ser80 and Lys84 from an adjacent catalytic chain. The active site is a highly positively charged pocket. One of the most critical side chains is from Arg54, which interacts with a terminal oxygen and the anhydride oxygen of carbamoyl phosphate, stabilizing the negative charge of the leaving phosphate group. Arg105, His134, and Thr55 help to increase the electrophilicity of the carbonyl carbon by interacting with the carbonyl oxygen. This quaternary structure change is associated with alterations in inter subunit and inter domain interactions. The interaction between subunits C1 C4 and R1 is extensively modified during this conversion. In particular, there is large movement of amino acid residues 230–254, known collectively as the 240s loop. These residues are located at the cleft between the carbamoyl phosphate and aspartate domains at the C1 C4 interface. The overall outcome of these structural changes is that the two domains of each catalytic chain come closer together, ensuring a better contact with the substrates or their analogues. During this structural transition, some interactions between side chains are lost and some others are established. Studies have confirmed that the position of the 240s loop directly affects substrate binding in the corresponding active site. Earlier studies using site directed mutagenesis of the 240s loop showed that interactions between Asp271 and Tyr240, and between Glu239 of C1 and Tyr165 of C4 would stabilize the T state, while interactions between Glu239 of C1 and both Lys164 and Tyr165 of C4 would stabilize the R state. Located close to the 240s loop and the active site, the loop region encompassing residues 160–166 plays a role in both the internal architecture of the enzyme and its regulatory properties. In particular, the residue Asp162 interacts with Gln231 (known to be involved in aspartate binding), and binds the same residues in both the T and R states. A mutant that had this residue mutated to alanine showed a huge reduction in specific activity, a two fold decrease in the affinity for aspartate, a loss of homotropic cooperativity, and decreased activation by ATP. It was suggested that the change in the overall structure caused by the introduction of this residue affects other residues in the R1 C1, R1 C4 and C1 C4 interfaces, which are involved in the quaternary structure transition.

Сборка комплекса

Регуляторные и каталитические субъединицы существуют в виде слитых белковых гомологов, что является сильным свидетельством их взаимодействия. Два каталитических тримера и два регуляторных димера собираются, формируя промежуточное соединение аспартат-карбамоилтрансферазы, состоящее из 6 каталитических и 4 регуляторных субъединиц.