Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
ДНК-кітапханасының түрі
Type of DNA library
кДНК-кітапханасы (комплементарлы ДНҚ) клондалған фрагменттерінің жиынтығы, организмнің транскриптомының бір бөлігін құрайтын және "кітапхана" ретінде сақталатын қабылдаушы жасушалар жинағына енгізілген. кДНК ядрода толық транскрипцияланған мРНҚ-дан синтезделеді, сондықтан организмнің тек экспрессияланатын гендерін ғана қамтиды. Сол сияқты, тіндікке тән кДНК-кітапханаларын да жасауға болады. Эукариотикалық жасушаларда пісіп жетілген мРНҚ-ның интронсыз түрі болады, сондықтан алынған кДНК интронсыз және бактериялық жасушада оңай экспрессияланады. кДНК-кітапханаларындағы ақпарат ген өнімдерін оңай анықтауға мүмкіндік беретін қуатты және пайдалы құрал болғанымен, геномдық ДНК-кітапханаларында кездесетін энхансерлер, интронтар және басқа да реттеуші элементтер туралы ақпаратта мүлдем жоқ.
A cDNA library is a combination of cloned cDNA (complementary DNA) fragments inserted into a collection of host cells, which constitute some portion of the transcriptome of the organism and are stored as a "library". cDNA is produced from fully transcribed mRNA found in the nucleus and therefore contains only the expressed genes of an organism. Similarly, tissue specific cDNA libraries can be produced. In eukaryotic cells the mature mRNA is already spliced, hence the cDNA produced lacks introns and can be readily expressed in a bacterial cell. While information in cDNA libraries is a powerful and useful tool since gene products are easily identified, the libraries lack information about enhancers, introns, and other regulatory elements found in a genomic DNA library.
cDNA кітапханасының құрылысы
cДНК эукариоттық клетканың піскен мРНК-сынан кері транскриптаза көмегімен синтезделеді. Эукариоттарда поли(А) құйрығы (ұзақ аденоин нуклеотидтері тізбегінен тұрады) мРНК-ны тРНК-дан және рРНК-дан ерекшелендіреді, демек кері транскрипция үшін бастау орны ретінде қолданылуы мүмкін. Алайда, барлық транскрипттер, мысалы, гистонға арналған транскрипттер, поли(А) құйрығын кодтамайды.
cDNA is created from a mature mRNA from a eukaryotic cell with the use of reverse transcriptase. In eukaryotes, a poly (A) tail (consisting of a long sequence of adenine nucleotides) distinguishes mRNA from tRNA and rRNA and can therefore be used as a primer site for reverse transcription. This has the problem that not all transcripts, such as those for the histone, encode a poly A tail.
mRNA экстракциясы
Біріншіден, сДНК кітапханаларын жасау үшін мРНК шаблоны оқшаулануы керек. mRNA тек экзондарды ғана қамтитындықтан, кодталған белок әлі де өндірілуі үшін оқшауланған mRNA-ның сақталуын ескеру қажет. Оқшауланған mRNA 500 бп-ден 8 кб-ға дейін болуы тиіс. РНҚ-ны тазарту үшін тризолмен экстракциялау және бағана арқылы тазарту сияқты бірнеше әдіс бар. Бағана арқылы тазарту, олигомерлік dT нуклеотидтерімен жабылған шайырларды қолдану арқылы жүзеге асырылуы мүмкін, сондай-ақ поли(А) құйрығы сияқты mRNA ерекшеліктері пайдаланылуы мүмкін, онда тек осы ерекшелікті қамтитын mRNA тізбектері ғана байланысады. Содан кейін бағанаға байланысқан қажетті mRNA элюцияланады.
Firstly, mRNA template needs to be isolated for the creation of cDNA libraries. Since mRNA only contains exons, the integrity of the isolated mRNA should be considered so that the protein encoded can still be produced. Isolated mRNA should range from 500 bp to 8 kb. Several methods exist for purifying RNA such as trizol extraction and column purification. Column purification can be done using oligomeric dT nucleotide coated resins, and features of mRNA such as having a poly A tail can be exploited where only mRNA sequences containing said feature will bind. The desired mRNA bound to the column is then eluted.
cДНК құрылымы
МРНК тазартылғаннан кейін, олиго dT праймері (дезокситимидин нуклеотидтерінің қысқа тізбегі) РНК-ның поли-А құйрығына байланысады. Бұл праймер кері транскриптаза ферменті арқылы ДНК синтезін бастау үшін қажет. Нәтижесінде, РНК-ДНҚ гибридтері пайда болады, онда мРНК жіпшесіне толықтыратын ДНҚ жіпшесі байланысады.
Once mRNA is purified, an oligo dT primer (a short sequence of deoxy thymidine nucleotides) is bound to the poly A tail of the RNA. The primer is required to initiate DNA synthesis by the enzyme reverse transcriptase. This results in the creation of RNA DNA hybrids where a single strand of complementary DNA is bound to a strand of mRNA.
cDNA кітапханасы мен геномдық ДНК кітапханасы
cДНК кітапханасында геномдық ДНК-да болатын кодтамайтын және реттеуші элементтер жоқ. Геномдық ДНК кітапханалары организм туралы толыққанды мәліметтер ұсынады, бірақ оларды жасау және сақтау көбірек ресурстарды қажет етеді.
cDNA library lacks the non coding and regulatory elements found in genomic DNA. Genomic DNA libraries provide more detailed information about the organism, but are more resource intensive to generate and keep.
КДН-ны клондау
кДНК молекулаларын шектеу орны линкерлерін қолдану арқылы клондауға болады. Линкерлер – қысқа, екі тізбекті ДНК (олигодеоксирибонуклеотид) фрагменттері, ұзындығы 8-12 нуклеотид жұбынан тұрады және рестрикциялық эндонуклеазаның кесу орнын қамтиды, мысалы, BamHI. КДНК-ның да, линкердің де тегіс ұштары бар, оларды жоғары концентрациядағы Т4 ДНК лигазасын пайдаланып біріктіруге болады. Содан кейін, кДНК молекуласының ұштарын (қазір енгізілген орны бар линкерлермен) тиісті эндонуклеазамен кесу арқылы жабысқақ ұштары жасалады. Клондау векторы (плазмид) да тиісті эндонуклеазамен кесіледі. Инсертті векторға "жабысқақ ұштарымен" біріктіргеннен кейін алынған рекомбинантты ДНК молекуласы клондау үшін E. coli қабылдаушы жасушасына көшіріледі.
cDNA molecules can be cloned by using restriction site linkers. Linkers are short, double stranded pieces of DNA (oligodeoxyribonucleotide) about 8 to 12 nucleotide pairs long that include a restriction endonuclease cleavage site e. g. BamHI. Both the cDNA and the linker have blunt ends which can be ligated together using a high concentration of T4 DNA ligase. Then sticky ends are produced in the cDNA molecule by cleaving the cDNA ends (which now have linkers with an incorporated site) with the appropriate endonuclease. A cloning vector (plasmid) is then also cleaved with the appropriate endonuclease. Following "sticky end" ligation of the insert into the vector the resulting recombinant DNA molecule is transferred into E. coli host cell for cloning.