Ген ішіндегі интрон аймақтары және олардың түрлері

Кіріспе

Ген ішіндегі нақты негіз жұптары тізбегі. Интрон – түпкі РНК өнімінде экспрессияланбайтын немесе жұмыс істемейтін ген ішіндегі кез келген нуклеотидтік тізбек. "Интрон" сөзі "интрагендік аймақ", яғни геннің ішіндегі аймақ терминінен туындаған. Интрон термині гендегі ДНҚ тізбегін және РНК транскрипттеріндегі сәйкес РНК тізбегін білдіреді. РНК өңдеу арқылы пісіп жетілген РНК-ны құрау үшін біріктірілетін интрон емес тізбектер экзондар деп аталады. Интрондар эукариоттардың көпшілігінің және көптеген эукариоттық вирустардың гендерінде кездеседі, және олар ақуызды кодтайтын гендерде де, РНК ретінде (кодтамайтын гендерде) жұмыс істейтін гендерде де болуы мүмкін. Интрондардың төрт негізгі түрі бар: тРНК интрондары, I топтағы интрондар, II топтағы интрондар және сплайцеосомалық интрондар (төменде қараңыз). Интрондар бактериялар мен археяларда (прокариоттарда) сирек кездеседі.

Табылды және этимологиясы

Интрондар алғаш рет аденовирустың ақуызды кодтайтын гендерінде табылды, содан кейін трансфер РНК және рибосома РНК гендерін кодтайтын гендерде анықталды. Қазіргі кезде интрондар барлық биологиялық царстволардағы организмдердің, бактериялардың және вирустардың әртүрлі гендерінде кездесетіні белгілі. Гендердің интрондармен бөлінуі немесе үзілуі 1977 жылы Филипп Аллен Шарп пен Ричард Дж. Робертс тәуелсіз түрде анықтады, осыған байланысты олар 1993 жылы физиология және медицина саласындағы Нобель сыйлығын бөлісті. "Интрон" терминін американдық биохимик Уолтер Гилберт енгізді:

Интрондар кейде аралық тізбектер деп аталса да, "аралық тізбек" термині соңғы ген өнімінде жоқ ішкі нуклеин қышқылының бірнеше отбасыларын қамтиды, олардың ішінде интейндер, трансляцияланбаған аймақтар (UTR) және РНК редакциялау арқылы алынып тасталған нуклеотидтер, сондай-ақ интрондар да бар.

Тарату

Интрондардың жиілігі әртүрлі геномдарда биологиялық организмдердің кең спектрінде айқын түрде өзгереді. Мысалы, интрондар жақ сүйекті омыртқалы жануарлардың ядролық геномдарында (адам, егеуқұйрық, және фугу балығы сияқты) өте көп кездеседі, онда ақуызды кодтайтын гендер көбінесе бірнеше интрондарды қамтиды, ал кейбір эукариотты микроорганизмдердің ядролық гендерінде интрондар сирек болады, мысалы, нан пісіруші/сыра жасаушы ашытқы (Saccharomyces cerevisiae). Керісінше, омыртқалы жануарлардың митохондриялық геномдарында интрондар мүлдем жоқ, бірақ эукариотты микроорганизмдерде көптеген интрондар болуы мүмкін. Ерекше жағдай – Drosophila dhc7 генінде ≥3,6 мегабазалық (Mb) интрон бар, оның транскрипциялануы шамамен үш күнге созалады. Ал, 2015 жылғы зерттеуге сәйкес, ең қысқа белгілі метазоандық интрон ұзындығы – адам MST1L геніне тән 30 негіз жұбын (bp) құрайды. Ең қысқа интрондар гетеротрих цилиаттарына тән, мысалы, Stentor coeruleus, олардың көпшілігі (>95%) 15 немесе 16 бп ұзындығында болады.

Сплицесомалық интрондар

Ядролық алдын-мРНК интрондары (сплицеосомалық интрондар) интрон мен экзон арасындағы шекараларда орналасқан нақты интрон тізбектерімен сипатталады. Бұл тізбектер шплицеосомалық РНК молекулалары шплицирлеу реакциялары басталар кезде таниды. Сонымен қатар, олардың құрамында тармақталу нүктесі болады – интронның 3' ұшына жақын орналасқан нақты нуклеотидтік тізбек, ол шплицирлеу процесінде интронның 5' ұшымен ковалентті байланысып, тармақталған интрон құрайды. Осы үш қысқа сақталған элементтен басқа, ядролық алдын-мРНК интрон тізбектері өте өзгергіш. Ядролық алдын-мРНК интрондары көбінесе оларды қоршап тұрған экзондардан әлдеқайда ұзын болады.

tRNA интрондары

Ақуыздардың араласуымен алынып тасталатын трансфер РНК интрондары, тігілмеген тРНК прекурсорларының антикодон циклындағы нақты бір жерде кездеседі және тРНК тігілу эндонуклеазасымен жойылады. Экзондар содан кейін екінші ақуыз – тРНК тігілу лигазы арқылы біріктіріледі. Өзін-өзі тігілетін интрондар кейде тРНК гендерінде де табылуы мүмкін екенін ескеріңіз.

I топ және II топ интрондары

І және ІІ топтағы интрондар тірі организмдердің өте кең ауқымында белоктарды (мессенджер РНК), трансфер РНК және рибосомалық РНК кодтайтын гендерде кездеседі. РНК-ға транскрипцияланғаннан кейін, І және ІІ топтағы интрондар да кең ауқымды ішкі өзара әрекеттесулер жасайды, бұл оларға нақты, күрделі үш өлшемді архитектураға жиналуға мүмкіндік береді. Бұл күрделі архитектуралар кейбір І және ІІ топтағы интрондардың өздігінен тігілуіне мүмкіндік береді, яғни интроннан тұратын РНК молекуласы өзінің ковалентті құрылымын интронның дәл жойылуы және экзондардың дұрыс ретпен біріктірілуі үшін өздігінен қайта құрастыра алады. Кейбір жағдайларда, белгілі бір интрон байланыстыратын ақуыздар тігілуге қатысады, олар интронға өздігінен тігілу белсенділігі үшін қажетті үш өлшемді құрылымға жиналуына көмектеседі. І және ІІ топтағы интрондар әртүрлі ішкі сақталған тізбектер мен жиналған құрылымдар арқылы, сондай-ақ ІІ топтағы интрондарды қамтитын РНК молекулаларын тігу нәтижесінде тармақталған интрондардың (сплайсосомалық РНК-ларға ұқсас) пайда болуымен ерекшеленеді, ал І топтағы интрондар тігуді бастау үшін кодталмаған гуанозин нуклеотидін (әдетте GTP) пайдаланады, оны кесілген интронның 5' ұшына қосады.

Тігістірудің дәлдігі туралы

Сплицеосома – жүзге жуық ақуыз бен бес түрлі РНК-дан тұратын өте күрделі құрылым. Реакцияның субстраты – ұзын РНК молекуласы, ал сплицеосома катализдейтін трансэстерификация реакциялары мыңдаған нуклеотидтер арақашықтықтағы сайттарды жақындастыруды қажет етеді. Барлық биохимиялық реакциялар белгілі бір қателік деңгейімен байланысты, және реакция неғұрлым күрделі болса, қателік деңгейі де соғұрлым жоғары болады. Сондықтан, сплицеосома катализдейтін шплицинг реакциясының қателік деңгейі жоғары болуы заңды, тіпті сплицеосоманың қосымша факторлары криптографиялық шплицеосомалық орындардың кездейсоқ жарылуын басуға тырысқанмен де. Идеалды жағдайда, шплицинг реакциясы 99,999% дәлдікке ие болуы мүмкін (қателік деңгейі 10−5), дұрыс экзондар біріктіріліп, дұрыс интрондар жойылады. Дегенмен, бұл идеалды жағдайлар ең жақсы шплицеосомалық сайттар тізбегімен өте жақын сәйкестікті және интрондардағы кез келген бәсекелес криптографиялық шплицеосомалық сайттар тізбегінің болмауын талап етеді. Ал мұндай жағдайлар 40 килобазалық жұптан астамды қамтитын ірі эукариоттық гендерде сирек кездеседі. Жақындағы зерттеулер көрсеткендей, нақты қателік деңгейі 10−5-тен әлдеқайда жоғары болуы мүмкін, тіпті ген үшін 2% немесе 3% қателікке (қателік деңгейі 2 немесе 3 x 10−2) жете алуы мүмкін. Қосымша зерттеулер қателік деңгейі интрон үшін 0,1% кем емес екенін көрсетеді. Бұл салыстырмалы түрде жоғары шплицинг қателерінің деңгейі көптеген шплицеосомалық варианттардың тез бұзылуын түсіндіреді. Гендердегі байланыс орындарының нашар байланысуы шплицинг қателеріне әкеледі, және осы орындардың табиғи сұрыпталу арқылы жойылмауы таңғаларлық көрінуі мүмкін. Олардың сақталуына қатысты аргументтер "құр ДНК" үшін келтірілген аргументтерге ұқсас. Байланыс орындарын құратын немесе бұзатын мутациялар сәл зиянды болуы мүмкін, бірақ мұндай мутациялардың көп саны болғандықтан, олардың кейбіреуі популяцияда бекітілуіне әкелуіне болады. Бұл, әсіресе, адамдар сияқты салыстырмалы түрде кішкентай ұзақ мерзімді тиімді популяция мөлшеріне ие түрлер үшін маңызды. Осыған байланысты, адам геномында аберрант транскрипт изоформаларын тудыратын оңтайлы емес тізбектердің көп мөлшері бар болуы мүмкін. Осы зерттеуде біз осыған тікелей дәлелдер келтіреміз. Мутантты аллель гетерозиготалық күйде болғанда, екі көп мөлшерде кездесетін шплицеосомалық вариант пайда болады: біреуі функционалды, екіншісі функционалды емес. Гомозиготалық күйде мутантты аллельдер Виктория патшайымының ұрпақтарында кездесетін гемофилия сияқты генетикалық ауруды тудыруы мүмкін, онда қан ұю факторы геніндегі интронның бірінде мутация пайда болып, 3' криптографиялық шплицеосомалық сайтты құрайды, нәтижесінде аберрант шплицинг пайда болады. Адамдардың аурудан өлімінің елеулі бөлігі қалыпты шплицингке кедергі келтіретін мутацияларға байланысты болуы мүмкін, көбінесе криптографиялық шплицеосомалық сайттарды құру арқылы.

The spliceosome is a very complex structure containing up to one hundred proteins and five different RNAs. The substrate of the reaction is a long RNA molecule and the transesterification reactions catalyzed by the spliceosome require the bringing together of sites that may be thousands of nucleotides apart. All biochemical reactions are associated with known error rates and the more complicated the reaction the higher the error rate. Therefore, it is not surprising that the splicing reaction catalyzed by the spliceosome has a significant error rate even though there are spliceosome accessory factors that suppress the accidental cleavage of cryptic splice sites. Under ideal circumstances, the splicing reaction is likely to be 99.999% accurate (error rate of 10−5) and the correct exons will be joined and the correct intron will be deleted. However, these ideal conditions require very close matches to the best splice site sequences and the absence of any competing cryptic splice site sequences within the introns and those conditions are rarely met in large eukaryotic genes that may cover more than 40 kilobase pairs. Recent studies have shown that the actual error rate can be considerably higher than 10−5 and may be as high as 2% or 3% errors (error rate of 2 or 3 x 10−2) per gene. Additional studies suggest that the error rate is no less than 0.1% per intron. This relatively high level of splicing errors explains why most splice variants are rapidly degraded by nonsense mediated decay. The presence of sloppy binding sites within genes causes splicing errors and it may seem strange that these sites haven't been eliminated by natural selection. The argument for their persistence is similar to the argument for junk DNA. <blockquote>Although mutations which create or disrupt binding sites may be slightly deleterious, the large number of possible such mutations makes it inevitable that some will reach fixation in a population. This is particularly relevant in species, such as humans, with relatively small long term effective population sizes. It is plausible, then, that the human genome carries a substantial load of suboptimal sequences which cause the generation of aberrant transcript isoforms. In this study, we present direct evidence that this is indeed the case. When the mutant allele is in a heterozygous state this will result in production of two abundant splice variants; one functional and one non functional. In the homozygous state the mutant alleles may cause a genetic disease such as the hemophilia found in descendants of Queen Victoria where a mutation in one of the introns in a blood clotting factor gene creates a cryptic 3' splice site resulting in aberrant splicing. A significant fraction of human deaths by disease may be caused by mutations that interfere with normal splicing; mostly by creating cryptic splice sites.

Биологиялық функциялар мен эволюция

Интрондар ақуыз өнімдерін кодтамайды, бірақ гендік экспрессияны реттеудің ажырамас бөлігі болып табылады. Кейбір интрондар өзіндік функционалдық РНК-ны кодтауға және дәнекерлеуден кейін кодтамайтын РНК молекулаларын жасау үшін қосымша өңдеуден өтуге мүмкіндік береді. Альтернативті дәнекерлеу бір геннен бірнеше ақуызды өндіру үшін кеңінен қолданылады. Сонымен қатар, кейбір интрондар гендік экспрессияны реттеу функцияларының кең ауқымында маңызды рөл атқарады, мысалы, мағынасыздықпен араласқан ыдырауы және мРНК экспорты. Эукариоттық ядродағы ақуызды кодтайтын гендерде интрондардың алғаш рет табылуынан кейін, қазіргі организмдердегі интрондар ортақ ежелгі ата-тектен мұрагерлікке алынған (интрондар ерте гипотезасы) немесе олар эволюциялық процесте гендерде жақында пайда болған (интрондар кеш гипотезасы) деген маңызды пікірталас туды. Тағы бір теория бойынша, сплайцеосома және гендердің интрон-экзон құрылымы РНК әлемінің қалдығы болып табылады (интрондар бірінші гипотезасы). Бұл гипотезалардың қайсысы дұрыс екендігі туралы пікірталас әлі де жалғасуда, бірақ қазіргі уақыттағы басым консенсус бойынша, бірінші эукариоттық жасушаның пайда болуынан кейін бактериялық эндосимбионттың II тобына жататын интрондар жаңа қонақ иесінің геномына енген. Бастапқыда бұл өздігінен дәнекерленетін интрондар мРНК прекурсорынан өздерін алып тастады, бірақ уақыт өте келе олардың кейбіреулері бұл қабілетін жоғалтты және оларды алып тастау үшін басқа II тобына жататын интрондардың көмегі қажет болды. Соңында, бірқатар спецификалық транс-активті интрондар пайда болды және олар сплайцеосоманың snРНК-ларының алғы құрылымдарына айналды. Дәнекерлеудің тиімділігін арттыру үшін тұрақтандырушы ақуыздармен байланысып, алғашқы сплайцеосома құрылды. Әртүрлі организмдердің геномдық ДНҚ тізбектерін зерттеудің алғашқы кезеңдерінде гомологты гендердің интрон-экзон құрылымы әртүрлі организмдерде кеңінен өзгеруі мүмкін екені анықталды. Еукариоттық геномдарды зерттеудің соңғы нәтижелері интрондардың ұзындығы мен тығыздығының (интрондар/ген) туысқан түрлер арасында айтарлықтай өзгеретінін көрсетті. Мысалы, адам геномында орташа есеппен 8,4 интрон/ген (139 418 геномда) кездеседі, ал бір жасушалы саңырауқұлақ Encephalitozoon cuniculi геномында тек 0,0075 интрон/ген (15 геномдағы интрондар) бар. Эукариоттардың ортақ ата-текке ие болғандықтан, эволюциялық уақыт ішінде интрондардың көптеп пайда болуы немесе жоғалуы болған деуге болады. Бұл процеске табиғи іріктеу түрткіс береді деп есептеледі, үлкен түрлерде олардың популяциясының кішігірім болуына байланысты интрондардың пайда болуына бейімділік танытады, ал кішірек (әсіресе бір жасушалы) түрлерде керісінше. Биологиялық факторлар да геномдағы гендердің интрондарды жоғалтуына немесе жинақтауына әсер етеді. Интрондарды кесуден кейін ген ішіндегі экзондардың баламалы дәнекерленуі бір геннен аударылған ақуыздар тізбектерінің әртүрлілігін арттырады, соның нәтижесінде бір геннен және бір прекурсорлық мРНК транскриптінен бірнеше байланысты ақуыздар жасалуы мүмкін. Баламалы РНК дәнекерлеуін басқаруды жасуша ішіндегі және жасуша сыртындағы сигналдардың кең ауқымына жауап беретін сигналды молекулалардың күрделі желісі жүзеге асырады. Интрондарда тиімді дәнекерлеу үшін маңызды бірнеше қысқа тізбектер бар, мысалы, интронның екі шетіндегі акцептор және донор сайттары, сондай-ақ сплайцеосомамен дұрыс дәнекерлеу үшін қажетті тармақ нүктесі. Кейбір интрондар интрон арқылы күшейтілген экспрессия (IME) деп аталатын процесс арқылы олар қамтылған геннің экспрессиясын арттырады. ДНҚ-ның белсенді транскрипцияланатын аймақтары жиі ДНҚ зақымдануына осал R циклдерін құрайды. Ашытқы гендерінде интрондар R циклдерінің пайда болуын және ДНҚ зақымдануын тежейді. Ашытқы мен адам геномдарындағы талдаулар интрондар бар гендерде R циклдерінің деңгейі төмендегенін және ұқсас экспрессия деңгейіне ие интрондарсыз гендерге қарағанда ДНҚ зақымдануы азайғанын көрсетті.

While introns do not encode protein products, they are integral to gene expression regulation. Some introns themselves encode functional RNAs through further processing after splicing to generate noncoding RNA molecules. Alternative splicing is widely used to generate multiple proteins from a single gene. Furthermore, some introns play essential roles in a wide range of gene expression regulatory functions such as nonsense mediated decay and mRNA export. After the initial discovery of introns in protein coding genes of the eukaryotic nucleus, there was significant debate as to whether introns in modern day organisms were inherited from a common ancient ancestor (termed the introns early hypothesis), or whether they appeared in genes rather recently in the evolutionary process (termed the introns late hypothesis). Another theory is that the spliceosome and the intron exon structure of genes is a relic of the RNA world (the introns first hypothesis). There is still considerable debate about the extent to which of these hypotheses is most correct but the popular consensus at the moment is that following the formation of the first eukaryotic cell, group II introns from the bacterial endosymbiont invaded the host genome. In the beginning these self splicing introns excised themselves from the mRNA precursor but over time some of them lost that ability and their excision had to be aided in trans by other group II introns. Eventually a number of specific trans acting introns evolved and these became the precursors to the snRNAs of the spliceosome. The efficiency of splicing was improved by association with stabilizing proteins to form the primitive spliceosome. Early studies of genomic DNA sequences from a wide range of organisms show that the intron exon structure of homologous genes in different organisms can vary widely. More recent studies of entire eukaryotic genomes have now shown that the lengths and density (introns/gene) of introns varies considerably between related species. For example, while the human genome contains an average of 8.4 introns/gene (139,418 in the genome), the unicellular fungus Encephalitozoon cuniculi contains only 0.0075 introns/gene (15 introns in the genome). Since eukaryotes arose from a common ancestor (common descent), there must have been extensive gain or loss of introns during evolutionary time. This process is thought to be subject to selection, with a tendency towards intron gain in larger species due to their smaller population sizes, and the converse in smaller (particularly unicellular) species. Biological factors also influence which genes in a genome lose or accumulate introns. Alternative splicing of exons within a gene after intron excision acts to introduce greater variability of protein sequences translated from a single gene, allowing multiple related proteins to be generated from a single gene and a single precursor mRNA transcript. The control of alternative RNA splicing is performed by a complex network of signaling molecules that respond to a wide range of intracellular and extracellular signals. Introns contain several short sequences that are important for efficient splicing, such as acceptor and donor sites at either end of the intron as well as a branch point site, which are required for proper splicing by the spliceosome. Some introns are known to enhance the expression of the gene that they are contained in by a process known as intron mediated enhancement (IME). Actively transcribed regions of DNA frequently form R loops that are vulnerable to DNA damage. In highly expressed yeast genes, introns inhibit R loop formation and the occurrence of DNA damage. Genome wide analysis in both yeast and humans revealed that intron containing genes have decreased R loop levels and decreased DNA damage compared to intronless genes of similar expression.

Жылжымалы генетикалық элементтер ретінде

Интрондар эволюциялық уақыт ішінде жоғалуы немесе пайда болуы мүмкін, бұл ортологты гендерді салыстырмалы зерттеулер арқылы көрсетілген. Келесі талдаулар интрондардың жоғалуы мен пайда болуының мыңдаған мысалдарын анықтады және эукариоттардың пайда болуы немесе эукариоттық эволюцияның бастапқы кезеңдері интрондардың енуін қамтиды деп болжам жасалды. Интрондар жоғалуының екі анық механизмі – кері транскриптаза арқылы интрондар жоғалуы (RTMIL) және геномдық жойылулар – анықталды және олардың болатыны белгілі. Алайда, интрондар пайда болуының анық механизмдері әлі де түсініксіз және даулы. Қазірге дейін интрондар пайда болуының кем дегенде жеті механизмі сипатталған: интрондардың транспозициясы, транспозонның енуі, тандемдік геномдық дупликация, интрондардың трансфері, қос тізбектің үзілуі кезінде интрондардың пайда болуы (DSBR), II топтағы интронның енуі және интронизация. Теория бойынша, жаңадан пайда болған интрондардың тегін анықтау оңайырақ болуы керек, себебі иесінің тудырған мутацияларының болмауы, бірақ тіпті жақында ғана пайда болған интрондар да жоғарыда аталған механизмдердің ешқайсысынан туындамаған. Осылайша, бұл нәтижелер интрондар пайда болуының ұсынылған механизмдері көптеген жаңа интрондардың механизмдік тегін дұрыс сипаттамайды ма, себебі олар интрондар пайда болуының нақты механизмдері емес, әлде басқа, әлі ашылмаған процестер жаңа интрондарды тудырады ма деген сұрақ тудырады. Интрондардың транспозициясында, ең көп таралған интрондар пайда болу механизмі, шплицтелген интрон өзінің немесе басқа мРНК-ға бұрын интрондар аз болған орынға кері шплицтеледі деп есептеледі. Бұл интрон бар мРНК кері транскрипцияланады және алынған интрон бар кДНК түпнұсқа геномдық локуспен толық немесе ішінара рекомбинация арқылы интрондардың пайда болуына себеп болуы мүмкін. Транспозонның енуі әртүрлі эукариот түрлерінде мыңдаған жаңа интрондарды тудырады. Транспозонның енуі кейде осы тізбектің транспозонның екі жағында да қайталануына әкеледі. Мұндай ену транспозон AGGT тізбегіне енгенде немесе транспозон тізбегіндегі тіркесімді орындарды кодтағанда кодтау тізбегін бұзбай, транспозонды интронизациялай алады. Интрондарды тудыратын транспозондар мақсатты сайттарда қайталануды жасамаса, элементтер GT (5') және AG (3') екі жапсырма сайттарын қамтиды, осылайша ақуызды кодтау тізбегіне әсер етпей дәл жапсырады. Бұл элементтердің неге кездейсоқ немесе транспозонның кейбір артықшылықты әрекеті арқылы біріктірілетіндігі әлі түсініксіз. Тандемдік геномдық дупликацияда, консенсустық донорлық және акцепторлық шплицтік сайттардың ұқсастығы, екеуі де AGGT-ге өте ұқсас, AGGT реттілігін қамтитын экзоникалық сегменттің тандемдік геномдық дупликациясы екі әлеуетті шплицтік сайтты тудырады. Сплицеосомамен танылған кезде түпнұсқа және қайталанған AGGT арасындағы тізбек шұғылдандырылады, нәтижесінде геннің кодтау тізбегін өзгертпей интрон пайда болады. Жақында зерттеушілер Daphnia-да алынған интрондардың 43% -ын қоршап тұратын қысқа тікелей қайталануларды анықтағанда, гомолог емес ұштарының бірігуі арқылы қос тізбектің үзілуі интрондар пайда болуының көзі ретінде анықталды. II топтағы интрондар, сондықтан, шплицеосомалық интрондардың болжамды ата-бабалары болып табылады, олар сайтқа тән ретроэлементтер ретінде әрекет етеді және енді интрондар пайда болуына жауапты емес. Тандемдік геномдық дупликация – in vivo эксперименттік дәлелдермен қолдау көрсетілген жалғыз ұсынылған механизм: қысқа интрагендік тандемдік дупликация ақуызды кодтайтын генге жаңа интронды енгізе алады, сәйкес пептидтік тізбекті өзгертпей сақтайды. Бұл механизмде сондай-ақ тандемдік геномдық дупликация интрондар пайда болуының кең таралған механизмі деген идеяны қолдауға бағытталған жан-жақты жанама дәлелдер бар. Басқа ұсынылатын механизмдерді in vivo, әсіресе DSBR, интрондар трансфері және интронизация кезінде интрондар алуды сынау мүмкін, бірақ бұл механизмдерді интрондар алудың нақты механизмдері ретінде бекіту үшін оларды in vivo көрсету қажет. Бұдан әрі геномдық талдаулар, әсіресе популяция деңгейінде орындалған кезде, әр механизмнің салыстырмалы үлесін өлшеуге болады, мүмкін түрлер арасындағы интрондар пайда болуының әртүрлі деңгейлерін түсіндіретін түрлерге тән бейімділіктерді анықтауға болады.

Introns may be lost or gained over evolutionary time, as shown by many comparative studies of orthologous genes. Subsequent analyses have identified thousands of examples of intron loss and gain events, and it has been proposed that the emergence of eukaryotes, or the initial stages of eukaryotic evolution, involved an intron invasion. Two definitive mechanisms of intron loss, reverse transcriptase mediated intron loss (RTMIL) and genomic deletions, have been identified, and are known to occur. The definitive mechanisms of intron gain, however, remain elusive and controversial. At least seven mechanisms of intron gain have been reported thus far: intron transposition, transposon insertion, tandem genomic duplication, intron transfer, intron gain during double strand break repair (DSBR), insertion of a group II intron, and intronization. In theory it should be easiest to deduce the origin of recently gained introns due to the lack of host induced mutations, yet even introns gained recently did not arise from any of the aforementioned mechanisms. These findings thus raise the question of whether or not the proposed mechanisms of intron gain fail to describe the mechanistic origin of many novel introns because they are not accurate mechanisms of intron gain, or if there are other, yet to be discovered, processes generating novel introns. In intron transposition, the most commonly purported intron gain mechanism, a spliced intron is thought to reverse splice into either its own mRNA or another mRNA at a previously intron less position. This intron containing mRNA is then reverse transcribed and the resulting intron containing cDNA may then cause intron gain via complete or partial recombination with its original genomic locus. Transposon insertions have been shown to generate thousands of new introns across diverse eukaryotic species. Transposon insertions sometimes result in the duplication of this sequence on each side of the transposon. Such an insertion could intronize the transposon without disrupting the coding sequence when a transposon inserts into the sequence AGGT or encodes the splice sites within the transposon sequence. Where intron generating transposons do not create target site duplications, elements include both splice sites GT (5') and AG (3') thereby splicing precisely without affecting the protein coding sequence. It is not yet understood why these elements are spliced, whether by chance, or by some preferential action by the transposon. In tandem genomic duplication, due to the similarity between consensus donor and acceptor splice sites, which both closely resemble AGGT, the tandem genomic duplication of an exonic segment harboring an AGGT sequence generates two potential splice sites. When recognized by the spliceosome, the sequence between the original and duplicated AGGT will be spliced, resulting in the creation of an intron without alteration of the coding sequence of the gene. Double stranded break repair via non homologous end joining was recently identified as a source of intron gain when researchers identified short direct repeats flanking 43% of gained introns in Daphnia. Group II introns are therefore likely the presumed ancestors of spliceosomal introns, acting as site specific retroelements, and are no longer responsible for intron gain. Tandem genomic duplication is the only proposed mechanism with supporting in vivo experimental evidence: a short intragenic tandem duplication can insert a novel intron into a protein coding gene, leaving the corresponding peptide sequence unchanged. This mechanism also has extensive indirect evidence lending support to the idea that tandem genomic duplication is a prevalent mechanism for intron gain. The testing of other proposed mechanisms in vivo, particularly intron gain during DSBR, intron transfer, and intronization, is possible, although these mechanisms must be demonstrated in vivo to solidify them as actual mechanisms of intron gain. Further genomic analyses, especially when executed at the population level, may then quantify the relative contribution of each mechanism, possibly identifying species specific biases that may shed light on varied rates of intron gain amongst different species.