Введение
Тип ДНК-библиотеки
Библиотека кДНК – это совокупность клонированных фрагментов кДНК (комплементарной ДНК), вставленных в коллекцию клеток-хозяев, представляющая собой часть транскриптома организма и хранящаяся в виде "библиотеки". кДНК синтезируется из полностью транскрибированной мРНК, находящейся в ядре, и поэтому содержит только экспрессирующиеся гены организма. Аналогичным образом можно создавать тканеспецифичные библиотеки кДНК. В эукариотических клетках зрелая мРНК уже сплайсирована, следовательно, полученная кДНК лишена интронов и может быть легко экспрессирована в бактериальной клетке. Хотя информация, содержащаяся в библиотеках кДНК, является мощным и полезным инструментом, поскольку продукты генов легко идентифицируются, в этих библиотеках отсутствует информация об энхансерах, интронах и других регуляторных элементах, которые можно найти в геномной ДНК-библиотеке.
Строительство библиотеки cDNA
cДНК создается из зрелой мРНК эукариотической клетки с помощью обратной транскриптазы. У эукариот поли(А)-хвост (состоящий из длинной последовательности адениновых нуклеотидов) отличает мРНК от тРНК и рРНК и поэтому может быть использован в качестве сайта инициации обратной транскрипции. Однако это создает проблему, поскольку не все транскрипты, например, для гистонов, содержат поли(А)-хвост.
экстракция мРНК
Во-первых, для создания библиотек кДНК необходимо изолировать матрицу мРНК. Поскольку мРНК содержит только экзоны, следует учитывать целостность изолированной мРНК, чтобы обеспечивалась возможность производства кодируемого ею белка. Размер изолированной мРНК должен быть от 500 пар оснований до 8 килобаз. Существует несколько методов очистки РНК, таких как экстракция тризолом и очистка с помощью колонок. Очистка с помощью колонок может выполняться с использованием смол, покрытых олигомерными dT-нуклеотидами, и можно использовать особенности мРНК, такие как поли(А)-хвост, при котором к колонке связываются только последовательности мРНК, содержащие этот элемент. Затем желаемая мРНК, связанная с колонкой, элюируется.
Конструкция сДНК
После очистки мРНК олиго-dT праймер (короткая последовательность дезокситимидиновых нуклеотидов) присоединяется к поли-А хвосту РНК. Праймер необходим для инициации синтеза ДНК ферментом обратной транскриптазой. В результате образуются гибриды РНК-ДНК, в которых одна цепь комплементарной ДНК связана с цепью мРНК.
Библиотека cDNA против Библиотеки геномной ДНК
Библиотека кДНК лишена некодирующих и регуляторных элементов, присутствующих в геномной ДНК. Библиотеки геномной ДНК предоставляют более полную информацию об организме, но требуют больших затрат ресурсов на создание и поддержание.
Клонирование cDNA
Молекулы кДНК могут быть клонированы с использованием линкеров к участкам рестрикции. Линкеры – это короткие, двунитевые фрагменты ДНК (олигодезоксирибонуклеотиды) длиной примерно от 8 до 12 пар нуклеотидов, содержащие сайт расщепления рестрикционной эндонуклеазы, например, BamHI. Как кДНК, так и линкер имеют тупые концы, которые можно соединить вместе, используя высокую концентрацию ДНК-лигазы T4. Затем липкие концы создаются в молекуле кДНК путем расщепления концов кДНК (которые теперь содержат линкеры с включенным сайтом) соответствующей эндонуклеазой. Клонирующий вектор (плазмида) также расщепляется соответствующей эндонуклеазой. После лигации вставки в вектор по липким концам полученная рекомбинантная молекула ДНК переносится в клетку-хозяина *E. coli* для клонирования.