Кіріспе
Жарық микроскопиясы үшін қолданылатын техника. Иммунофлуоресценция (IF) – жасуша немесе тіндерде сандық деңгейде мақсатты биомолекулалардың кең ауқымын анықтауға және орналасуын анықтауға мүмкіндік беретін, жарық микроскопиясына негізделген техника. Бұл техника антиденелер мен антигендердің байланысу ерекшелігін пайдаланады. Антигендегі антидене танитын нақты аймақ эпитоп деп аталады. Бірнеше антидене бір эпитопты тани алады, бірақ олардың байланысу туыстығы әртүрлі болады. Белгілі бір эпитопқа жоғары туыстығы бар антидене, сол эпитопқа төмен туыстығы бар антиденелерден басымдық танытады. Антиденені флюороформен қосыстыру арқылы, флюорофорды қозу және флуоресценттік микроскопты қолдану арқылы белгілі бір, алдын ала анықталған толқын ұзындығында жарық шығарылуын өлшеу арқылы мақсатты биомолекуланың орналасуын визуализациялауға болады. Флюорофордың антиденеге байланысуы антидененің иммунологиялық ерекшелігіне немесе оның антигенімен байланысу қабілетіне кедерілтін болмауы керек. Иммунофлуоресценция – иммунобояудың (протеиндерді бояу үшін антиденелерді пайдалану) кеңінен қолданылатын мысалы және иммуногистохимияның (тіндерде антидене-антиген қатынасын пайдалану) нақты мысалы. Бұл техника негізінен антиденелердің орналасуын визуализациялау үшін флюорофорларды пайдаланады, ал басқалары қызығушылық тудыратын антигені қамтитын ортаның түсін өзгертуге немесе радиоактивті белгілерді қолдануға мүмкіндік береді. Белгіленген антиденелерді пайдаланатын иммунофлуоресценттік техникалар 1940 жылдары Альберт Х. Кунспен ұсынылған. Иммунофлуоресценция ғылыми зерттеулерде және клиникалық диагностикада қолданылады, оның көп қырлы пайдалылығын түрлі субстраттарда, соның ішінде тіндердің кесінділерінде, өршілген жасуша желілерінде немесе жеке жасушаларда көрсетеді. Оның қолданылуына ақуыздардың, гликандардың, кішкентай биологиялық және биологиялық емес молекулалардың таралуын талдау және орташа өлшемді жіпшелер сияқты құрылымдарды визуализациялау жатады. Жасуша мембранасының топологиясы белгісіз болса, жасуша мембранасындағы құрылымдарды анықтау үшін эпитопты ақуыздарға енгізуді иммунофлуоресценциямен бірге қолдануға болады. Иммунофлуоресценция (IF) ДНК метилирлеу деңгейлері мен орналасу үлгілерін түсіну үшін «жартылай сандық» әдіс ретінде де қолданылуы мүмкін. IF сонымен қатар флуоресценттік бояудың антиденелік емес басқа әдістерімен, мысалы, ДНК-ны белгілеу үшін DAPI қолданумен бірге қолданылуы мүмкін. Иммунофлуоресценция үлгілерін зерттеу әртүрлі микроскоптық конфигурацияларды, соның ішінде эпифлуоресценциялық микроскопты, конфокалды микроскопты және кең өрісті микроскопты пайдалану арқылы жүргізілуі мүмкін.
Immunofluorescence (IF) is a light microscopy based technique that allows detection and localization of a wide variety of target biomolecules within a cell or tissue at a quantitative level. The technique utilizes the binding specificity of antibodies and antigens. The specific region an antibody recognizes on an antigen is called an epitope. Several antibodies can recognize the same epitope but differ in their binding affinity. The antibody with the higher affinity for a specific epitope will surpass antibodies with a lower affinity for the same epitope. By conjugating the antibody to a fluorophore, the position of the target biomolecule is visualized by exciting the fluorophore and measuring the emission of light in a specific predefined wavelength using a fluorescence microscope. It is imperative that the binding of the fluorophore to the antibody itself, do not interfere with the immunological specificity of the antibody or the binding capacity of its antigen. Immunofluorescence is a widely used example of immunostaining (using antibodies to stain proteins) and is a specific example of immunohistochemistry (the use of the antibody antigen relationship in tissues). This technique primarily utilizes fluorophores to visualize the location of the antibodies, while others provoke a color change in the environment containing the antigen of interest or make use of a radioactive label. Immunofluorescent techniques that utilized labelled antibodies was conceptualized in the 1940s by Albert H. Coons. Immunofluorescence is employed in foundational scientific investigations and clinical diagnostic endeavors, showcasing its multifaceted utility across diverse substrates, including tissue sections, cultured cell lines, or individual cells. Its usage includes analysis of the distribution of proteins, glycans, small biological and non biological molecules, and visualization of structures such as intermediate sized filaments. If the topology of a cell membrane is undetermined, epitope insertion into proteins can be used in conjunction with immunofluorescence to determine structures within the cell membrane. Immunofluorescence (IF) can also be used as a “semi quantitative” method to gain insight into the levels and localization patterns of DNA methylation. IF can additionally be used in combination with other, non antibody methods of fluorescent staining, e. g., the use of DAPI to label DNA. Examination of immunofluorescence specimens can be conducted utilizing various microscope configurations, including the epifluorescence microscope, confocal microscope, and widefield microscope.
Флуоресценция дайындау
Иммунофлюоресценциялық бояуды жүргізу үшін флюорофор антиденеге конъюгациялануы (белгіленуі) керек. Бояу процедуралары жасуша ішінде сақталған экспрессияланған антиденелерге де, тірі жасушалардың бетіндегі антигендерге де қолданылуы мүмкін. Иммунофлюоресценция техникаларының екі негізгі түрі бар: біріншілік (тікелей) және екіншілік (көмекші). Флюорофордың антиденеге тікелей қосылуы үлгіні дайындау процесіндегі қадамдар санын азайтады, уақытты үнемдейді және талдау кезінде спецификалық емес фондық сигналды төмендетеді.