Иммунофлуоресценция: метод световой микроскопии и его применение.
Immunofluorescence
Иммунофлуоресценция: метод световой микроскопии для обнаружения и локализации биомолекул в клетках и тканях. Основан на специфичности антител и антигенов.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Техника, используемая для световой микроскопии
Technique used for light microscopy
Иммунофлуоресценция (ИФ) – это метод, основанный на световой микроскопии, который позволяет обнаруживать и локализовать широкий спектр целевых биомолекул в клетке или ткани на количественном уровне. Метод использует специфичность связывания антител и антигенов. Специфическая область, которую антитело распознает на антигене, называется эпитопом. Несколько антител могут распознавать один и тот же эпитоп, но различаться по своей аффинности связывания. Антитело с более высокой аффинностью к определенному эпитопу будет превосходить антитела с более низкой аффинностью к тому же эпитопу. Путем конъюгации антитела с флюорофором, положение целевой биомолекулы визуализируется путем возбуждения флюорофора и измерения эмиссии света на определенной, заранее заданной длине волны с помощью флуоресцентного микроскопа. Важно, чтобы связывание флюорофора с самим антителом не нарушало иммунологическую специфичность антитела или способность его антигена к связыванию. Иммунофлуоресценция является широко используемым примером иммуноокрашивания (использование антител для окрашивания белков) и конкретным примером иммуногистохимии (использование взаимосвязи антиген-антитело в тканях). Эта техника в основном использует флюорофоры для визуализации местоположения антител, в то время как другие методы провоцируют изменение цвета в среде, содержащей интересующий антиген, или используют радиоактивную метку. Иммунофлуоресцентные методы с использованием меченых антител были разработаны в 1940-х годах Альбертом Х. Кунсом. Иммунофлуоресценция применяется в фундаментальных научных исследованиях и клинической диагностике, демонстрируя свою многогранную полезность на различных субстратах, включая срезы тканей, культивируемые клеточные линии или отдельные клетки. Ее применение включает анализ распределения белков, гликанов, малых биологических и небиологических молекул, а также визуализацию структур, таких как промежуточные филаменты. Если топология клеточной мембраны не определена, введение эпитопа в белки может быть использовано в сочетании с иммунофлуоресценцией для определения структур внутри клеточной мембраны. Иммунофлуоресценция (ИФ) также может использоваться как “полуколичественный” метод для получения информации об уровнях и паттернах локализации метилирования ДНК. ИФ может дополнительно использоваться в сочетании с другими, не основанными на антителах, методами флуоресцентного окрашивания, например, с использованием DAPI для мечения ДНК. Исследование образцов иммунофлуоресценции может проводиться с использованием различных конфигураций микроскопа, включая эпифлуоресцентный микроскоп, конфокальный микроскоп и широкопольный микроскоп.
Immunofluorescence (IF) is a light microscopy based technique that allows detection and localization of a wide variety of target biomolecules within a cell or tissue at a quantitative level. The technique utilizes the binding specificity of antibodies and antigens. The specific region an antibody recognizes on an antigen is called an epitope. Several antibodies can recognize the same epitope but differ in their binding affinity. The antibody with the higher affinity for a specific epitope will surpass antibodies with a lower affinity for the same epitope. By conjugating the antibody to a fluorophore, the position of the target biomolecule is visualized by exciting the fluorophore and measuring the emission of light in a specific predefined wavelength using a fluorescence microscope. It is imperative that the binding of the fluorophore to the antibody itself, do not interfere with the immunological specificity of the antibody or the binding capacity of its antigen. Immunofluorescence is a widely used example of immunostaining (using antibodies to stain proteins) and is a specific example of immunohistochemistry (the use of the antibody antigen relationship in tissues). This technique primarily utilizes fluorophores to visualize the location of the antibodies, while others provoke a color change in the environment containing the antigen of interest or make use of a radioactive label. Immunofluorescent techniques that utilized labelled antibodies was conceptualized in the 1940s by Albert H. Coons. Immunofluorescence is employed in foundational scientific investigations and clinical diagnostic endeavors, showcasing its multifaceted utility across diverse substrates, including tissue sections, cultured cell lines, or individual cells. Its usage includes analysis of the distribution of proteins, glycans, small biological and non biological molecules, and visualization of structures such as intermediate sized filaments. If the topology of a cell membrane is undetermined, epitope insertion into proteins can be used in conjunction with immunofluorescence to determine structures within the cell membrane. Immunofluorescence (IF) can also be used as a “semi quantitative” method to gain insight into the levels and localization patterns of DNA methylation. IF can additionally be used in combination with other, non antibody methods of fluorescent staining, e. g., the use of DAPI to label DNA. Examination of immunofluorescence specimens can be conducted utilizing various microscope configurations, including the epifluorescence microscope, confocal microscope, and widefield microscope.
Подготовка флуоресценции
Для выполнения иммунофлуоресцентного окрашивания флюорофор должен быть конъюгирован (таггирован) с антителом. Процедуры окрашивания могут применяться как к сохраненным внутриклеточно экспрессируемым антителам, так и к антигенам на поверхности клеток в живых клетках. Существует два основных класса методов иммунофлуоресценции: прямой и непрямой. Прямое присоединение флюорофора к антителу сокращает число этапов в процедуре подготовки образца, экономя время и снижая неспецифический фоновый сигнал при анализе.
To perform immunofluorescence staining, a fluorophore must be conjugated (“tagged”) to an antibody. Staining procedures can be applied to both retained intracellular expressed antibodies, or to cell surface antigens on living cells. There are two general classes of immunofluorescence techniques: primary (direct) and secondary (indirect). The direct attachment of the fluorophore to the antibody reduces the number of steps in the sample preparation procedure, saving time and reducing non specific background signal during analysis.