Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Геликазаға тәуелді амплификация (HDA) – ДНК-ны құрамында (in vitro) амплификациялау әдісі (полимераза тізбекті реакциясы сияқты), бұл тұрақты температурада жүзеге асырылады.
Helicase dependent amplification (HDA) is a method for in vitro DNA amplification (like the polymerase chain reaction) that takes place at a constant temperature.
Кіріспе
Полимераза тізбекті реакциясы молекулалық биология және биомедициналық зерттеулер үшін ДНК-ны in vitro күшейте түсу үшін ең көп қолданылатын әдіс болып табылады. Бұл процеске қос жіпті ДНК-ны жоғары температурада бір жіпке бөлу (денатурациялау сатысы, әдетте 95–97 °C-да жүзеге асырылады), праймерлерді бір жіпті ДНК-ға бекіту (жегіту сатысы) және жаңа қос жіпті ДНК-ны құру үшін бір жіптерді көшіру (ДНК полимеразасын қажет ететін кеңейту сатысы) кіреді. Реакцияны термиялық циклерде жүргізу қажет. Бұл үстелге арналған машиналар үлкен, қымбат және оларды пайдалану мен күтіп ұстау да қымбат, бұл ДНК-ны күшейте түсудің зертханадан тыс жағдайлардағы (мысалы, зерттеу орнындағы немесе науқастың жанындағы потенциалды қауіпті микроорганизмдерді анықтау сияқты) қолданылу мүмкіндігін шектейді. PCR көбінесе термиялық циклмен байланысты болғанымен, Муллис және авторлардың бастапқы патенты екі жіпті ДНК-ны денатурациялау үшін геликазаны пайдалануды, соның ішінде изотермиялық нуклеин қышқылының күшейте түсуін ашты. In vivo ДНК, ДНК полимеразалармен және түрлі қосымша ақуыздармен, соның ішінде ДНК-ны бұрап, бөлуге арналған ДНК-геликазамен көбейтіледі. Осы тұжырымдама негізінде HDA әзірленді, онда ДНК-ны денатурациялау үшін геликаза (фермент) қолданылады.
The polymerase chain reaction is the most widely used method for in vitro DNA amplification for purposes of molecular biology and biomedical research. This process involves the separation of the double stranded DNA in high heat into single strands (the denaturation step, typically achieved at 95–97 °C), annealing of the primers to the single stranded DNA (the annealing step) and copying the single strands to create new double stranded DNA (the extension step that requires the DNA polymerase) requires the reaction to be done in a thermal cycler. These bench top machines are large, expensive and costly to run and maintain, limiting the potential applications of DNA amplification in situations outside the laboratory (e. g., in the identification of potentially hazardous micro organisms at the scene of investigation, or at the point of care of a patient). Although PCR is usually associated with thermal cycling, the original patent by Mullis et al. disclosed the use of a helicase as a means for denaturation of double stranded DNA thereby including isothermal nucleic acid amplification. In vivo, DNA is replicated by DNA polymerases with various accessory proteins, including a DNA helicase that acts to separate the DNA by unwinding the DNA double helix. HDA was developed from this concept, using a helicase (an enzyme) to denature the DNA.
Әдістеме
Қос тізбекті ДНК жіптері алдымен ДНК-геликазамен бөлінеді және бір тізбекті ДНК (ssDNA) байланыстыратын ақуыздармен қапталады. Екінші қадамда, екі тізбекке сай келетін праймерлер ДНК қалыпының екі жағына гибридтеледі. ДНК полимеразалары содан кейін қалыптарға жабысқан праймерлерді ұзарту үшін қолданылады, нәтижесінде қос тізбекті ДНК пайда болады, ал екі жаңа синтезделген ДНК өнімі ДНК-геликазалармен субстраттар ретінде қолданылып, реакцияның келесі айналымына кіреді. Осылайша, бір уақытта тізбекті реакция дамиды, нәтижесінде таңдалған нысаналық тізбек экспоненциалды түрде күшейеді (схемалық сурет үшін Винсент және авторлар, 2004 жылды қараңыз).
Strands of double stranded DNA are first separated by a DNA helicase and coated by single stranded DNA (ssDNA) binding proteins. In the second step, two sequence specific primers hybridise to each border of the DNA template. DNA polymerases are then used to extend the primers annealed to the templates to produce a double stranded DNA and the two newly synthesized DNA products are then used as substrates by DNA helicases, entering the next round of the reaction. Thus, a simultaneous chain reaction develops, resulting in exponential amplification of the selected target sequence (see Vincent et al , 2004 for a schematic diagram).
Қазіргі жетістіктер және HDA артықшылықтары мен кемшіліктері
Оның ашылуы жарияланғанынан бері HDA технологиясы "Clostridium difficile-ді анықтау үшін қарапайым, оңай бейімделетін нуклеин қышқылының сынағы" ретінде қолданылуда. Басқа қолданыстарының бірі – Staphylococcus aureus бактериясына тән қысқа ДНК тізбектерін күшейту және анықтау арқылы оны жылдам анықтау. HDA-ның артықшылығы – бұл жылу циклерін қажет етпейтін, изотермиялық температурада белгілі бір нысананың нуклеин қышқылын жылдам күшейту әдісін ұсынады. Дегенмен, зерттеуші алдынан праймерлерді және кейде буферлерді оңтайландыру қажеттігі туындайды. Әдетте, праймерлер мен буферлерді оңтайландыру ПТР арқылы тестіленіп, жүзеге асырылады, бұл күшейтуді жүзеге асыру үшін жекелеген жүйеге қосымша қаражат жұмсау қажеттігі туралы сұрақ тудырады. HDA термоциклді пайдалану қажеттілігін жоққа шығарады және осылайша зерттеулерді өрісте жүргізуге мүмкіндік береді дегенімен, потенциалды қауіпті микроорганизмдерді анықтау үшін қажетті жұмылдың көп бөлігі зерттеу/ауруханалық зертхана жағдайында жүргізіледі. Қазіргі таңда HDA көмегімен көптеген үлгілерден жаппай диагноз қою мүмкін емес, ал термоциклде жүзеге асырылатын ПТР реакциялары, көп ұңғымалы пластиналарды ұстай алады, ең көп дегенде 96 үлгіден мақсатты ДНК-ны күшейтуге және анықтауға мүмкіндік береді. HDA үшін реагенттерді сатып алу құны ПТР реагенттеріне қарағанда салыстырмалы түрде жоғары, әсіресе ол дайын жиынтық түрінде келеді.
Since the publication of its discovery, HDA technology is being used for a "simple, easy to adapt nucleic acid test for the detection of Clostridium difficile". Other applications include the rapid detection of Staphylococcus aureus by the amplification and detection of a short DNA sequence specific to the bacterium. The advantages of HDA is that it provides a rapid method of nucleic acid amplification of a specific target at an isothermic temperature that does not require a thermal cycler. However, the optimisation of primers and sometimes buffers is required beforehand by the researcher. Normally primer and buffer optimisation is tested and achieved through PCR, raising the question of the need to spend extra on a separate system to do the actual amplification. Despite the selling point that HDA negates the use of a thermal cycler and therefore allows research to be conducted in the field, much of the work required to detect potentially hazardous microorganisms is carried out in a research/hospital lab setting regardless. At present, mass diagnoses from a great number of samples cannot yet be achieved by HDA, whereas PCR reactions carried out in thermal cycler that can hold multi well sample plates allows for the amplification and detection of the intended DNA target from a maximum of 96 samples. The cost of purchasing reagents for HDA are also relatively expensive to that of PCR reagents, more so since it comes as a ready made kit.