Изотермическая амплификация ДНК с использованием хеликаз (HDA)
Helicase-dependent amplification
Усиление ДНК HDA: альтернатива ПЦР без термоциклирования! Быстрая, дешевая амплификация ДНК при постоянной температуре для молекулярной биологии и диагностики.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Геликазозависимая амплификация (HDA) — это метод амплификации ДНК in vitro, подобный полимеразной цепной реакции, который осуществляется при постоянной температуре.
Helicase dependent amplification (HDA) is a method for in vitro DNA amplification (like the polymerase chain reaction) that takes place at a constant temperature.
Введение
Полимеразная цепная реакция является наиболее широко используемым методом амплификации ДНК in vitro для целей молекулярной биологии и биомедицинских исследований. Этот процесс включает разделение двухцепочечной ДНК при высокой температуре на одноцепочечные нити (этап денатурации, обычно достигаемый при 95–97 °C), отжиг праймеров к одноцепочечной ДНК (этап отжига) и копирование одноцепочечных нитей для создания новой двухцепочечной ДНК (этап элонгации, требующий ДНК-полимеразы). Для проведения реакции необходим термический циклизатор. Эти настольные приборы большие, дорогие и требуют значительных затрат на эксплуатацию и обслуживание, что ограничивает потенциальные области применения амплификации ДНК вне лаборатории (например, при идентификации потенциально опасных микроорганизмов на месте происшествия или при оказании медицинской помощи пациенту). Хотя ПЦР обычно ассоциируется с термическим циклированием, оригинальный патент Mullis et al. описывал использование геликазы для денатурации двухцепочечной ДНК, тем самым включая изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот. In vivo ДНК реплицируется ДНК-полимеразами с участием различных дополнительных белков, включая ДНК-геликазу, которая разделяет ДНК, раскручивая двойную спираль. HDA была разработана на основе этой концепции, с использованием геликазы (фермента) для денатурации ДНК.
The polymerase chain reaction is the most widely used method for in vitro DNA amplification for purposes of molecular biology and biomedical research. This process involves the separation of the double stranded DNA in high heat into single strands (the denaturation step, typically achieved at 95–97 °C), annealing of the primers to the single stranded DNA (the annealing step) and copying the single strands to create new double stranded DNA (the extension step that requires the DNA polymerase) requires the reaction to be done in a thermal cycler. These bench top machines are large, expensive and costly to run and maintain, limiting the potential applications of DNA amplification in situations outside the laboratory (e. g., in the identification of potentially hazardous micro organisms at the scene of investigation, or at the point of care of a patient). Although PCR is usually associated with thermal cycling, the original patent by Mullis et al. disclosed the use of a helicase as a means for denaturation of double stranded DNA thereby including isothermal nucleic acid amplification. In vivo, DNA is replicated by DNA polymerases with various accessory proteins, including a DNA helicase that acts to separate the DNA by unwinding the DNA double helix. HDA was developed from this concept, using a helicase (an enzyme) to denature the DNA.
Методология
Двухцепочечные молекулы ДНК сначала разделяются ДНК-геликазой и покрываются белками, связывающими одноцепочечную ДНК (ssDNA). На втором этапе два специфичных к последовательности праймера гибридизуются с каждой границей ДНК-матрицы. Затем ДНК-полимеразы используются для удлинения праймеров, отжигаемых к матрицам, с образованием двухцепочечной ДНК, а два вновь синтезированных продукта ДНК затем служат субстратами для ДНК-геликаз, запуская следующий раунд реакции. Таким образом, развивается цепная реакция, приводящая к экспоненциальному увеличению количества выбранной целевой последовательности (см. Vincent et al., 2004 для схематического представления).
Strands of double stranded DNA are first separated by a DNA helicase and coated by single stranded DNA (ssDNA) binding proteins. In the second step, two sequence specific primers hybridise to each border of the DNA template. DNA polymerases are then used to extend the primers annealed to the templates to produce a double stranded DNA and the two newly synthesized DNA products are then used as substrates by DNA helicases, entering the next round of the reaction. Thus, a simultaneous chain reaction develops, resulting in exponential amplification of the selected target sequence (see Vincent et al , 2004 for a schematic diagram).
Нынешний прогресс и преимущества и недостатки HDA
С момента публикации открытия технология HDA используется для "простого и легко адаптируемого теста на основе нуклеиновых кислот для обнаружения Clostridium difficile". Другие области применения включают быстрое выявление Staphylococcus aureus посредством амплификации и детекции короткой ДНК-последовательности, специфичной для этой бактерии. Преимущество HDA заключается в том, что она обеспечивает быстрый метод амплификации нуклеиновых кислот конкретной мишени при изотермической температуре, не требующий использования термоциклера. Однако исследователю необходимо предварительно оптимизировать праймеры и, в некоторых случаях, буферы. Обычно оптимизация праймеров и буферов тестируется и достигается с помощью ПЦР, что ставит вопрос о целесообразности дополнительных затрат на отдельную систему для проведения фактической амплификации. Несмотря на то, что HDA позволяет избежать использования термоциклера и, следовательно, проводить исследования в полевых условиях, большая часть работы по выявлению потенциально опасных микроорганизмов все равно выполняется в исследовательских/больничных лабораториях. В настоящее время HDA не позволяет проводить массовую диагностику большого количества образцов, в то время как ПЦР-реакции, выполняемые в термоциклерах, способных обрабатывать многолуночные планшеты, позволяют амплифицировать и детектировать целевую ДНК из максимум 96 образцов. Стоимость реагентов для HDA также относительно высока по сравнению с реагентами для ПЦР, особенно учитывая, что они поставляются в виде готовых наборов.
Since the publication of its discovery, HDA technology is being used for a "simple, easy to adapt nucleic acid test for the detection of Clostridium difficile". Other applications include the rapid detection of Staphylococcus aureus by the amplification and detection of a short DNA sequence specific to the bacterium. The advantages of HDA is that it provides a rapid method of nucleic acid amplification of a specific target at an isothermic temperature that does not require a thermal cycler. However, the optimisation of primers and sometimes buffers is required beforehand by the researcher. Normally primer and buffer optimisation is tested and achieved through PCR, raising the question of the need to spend extra on a separate system to do the actual amplification. Despite the selling point that HDA negates the use of a thermal cycler and therefore allows research to be conducted in the field, much of the work required to detect potentially hazardous microorganisms is carried out in a research/hospital lab setting regardless. At present, mass diagnoses from a great number of samples cannot yet be achieved by HDA, whereas PCR reactions carried out in thermal cycler that can hold multi well sample plates allows for the amplification and detection of the intended DNA target from a maximum of 96 samples. The cost of purchasing reagents for HDA are also relatively expensive to that of PCR reagents, more so since it comes as a ready made kit.