Биочиптер: Биохимиялық реакцияларды жүзеге асыратын субстраттар

Кіріспе

Биохимиялық реакцияларды жүзеге асыратын субстраттар

Молекулалық биологияда биочиптер – бір мезгілде көптеген биохимиялық реакцияларды өткізе алатын жасалған субстраттар ("кішірейтілген зертханалар"). Биочип технологиясының мақсаттарының бірі – көптеген биологиялық аналиттерді тиімді тексеру, оның мүмкін қолданылуы ауруды диагностикалаудан биотерроризм агенттерін анықтауға дейін. Мысалы, биомедициналық салаларда қолдану үшін цифрлық микрофлюидтік биочиптер зерттеліп жатыр. Цифрлық микрофлюидтік биочипте микрофлюидтік массивтегі (іргелес) жасушалар тобы сақтау, функционалдық операциялар, сондай-ақ сұйық тамшыларын динамикалық түрде тасымалдау үшін конфигурациялануы мүмкін.

Тарих

Даму негізгі сенсорлық технология бойынша алғашқы жұмыстардан басталды. Химиялық негіздегі алғашқы портативті сенсорлардың бірі – 1922 жылы Хьюз ойлап тапқан шыны pH электроды. Пермселективті мембраналарды құру үшін алмасу орындарын пайдаланудың негізгі қағидасы кейінгі жылдары басқа иондық сенсорларды жасау үшін қолданылды. Мысалы, K+ сенсоры валиномицинды жұқа мембранаға енгізу арқылы жасалды. 1953 жылы Уотсон мен Крик ДНҚ молекулаларының екі спиральді құрылымын ашты, бұл қазірге дейін жалғасып келе жатқан генетикалық зерттеулерге негіз салды. 1977 жылы Гилберт пен Сангер (жеке-жеке жұмыс істеген) тізбектеу әдістерін әзірледі, бұл зерттеушілерге белок синтезі үшін нұсқаулар беретін генетикалық кодтарды тікелей оқуға мүмкіндік берді. Бұл зерттеулер толыққанды қосылған олигонуклеотидтік тізбектерді гибридтеудің ДНҚ-ны анықтау үшін негіз ретінде қалай пайдаланылатынын көрсетті. Қазіргі заманғы ДНК-ға негізделген технологияны дамытуға екі маңызды жаңалық көмектесті. Біріншіден, 1983 жылы Кэри Муллис полимераза тізбектік реакциясы (ПТР) әдісін ойлап тапты, осылайша гибридтеу эксперименттерін оптикалық түрде бақылауға мүмкіндік берді. 1-суретте әдеттегі биочип платформасының құрылымы көрсетілген. Нақты сенсорлық компонент (немесе «чип») – толық талдау жүйесінің бір бөлігі ғана. ДНҚ байланысу, тотығу/тотықсыздану сияқты нақты сенсорлық оқиғаны компьютер түсінетін форматқа (кернеу, жарық интенсивтілігі, масса және т.б.) аудару үшін трансдукция жасалуы керек, содан кейін қосымша талдау мен өңдеуге мүмкіндік береді, нәтижесінде адам оқи алатын соңғы нәтиже шығады. Сәтті биочип жасау үшін қажетті көптеген технологиялар – химиялық сенсорлаудан бастап микромассивтерге дейін, сигналды өңдеуге дейін – шынайы көпсалалы тәсілді қажет етеді, бұл кіруге кедергі жасайды. Affymetrix компаниясы алғашқы коммерциялық биочиптердің бірін ұсынды. Олардың «GeneChip» өнімдері мыңдаған жеке ДНҚ сенсорларын қамтиды, олар р53 (омыршаларды басушы ген) және BRCA1 және BRCA2 (сүт безі қатерлі ісігімен байланысты) сияқты гендердегі ақауларды немесе жалғыз нуклеотидтік полиморфизмдерді (ЖНП) анықтау үшін қолданылады. Чиптер интегралдық схемаларды жасау үшін дәстүрлі түрде қолданылатын микролитография әдістерін пайдалану арқылы өндіріледі (төменде қараңыз).

The development started with early work on the underlying sensor technology. One of the first portable, chemistry based sensors was the glass pH electrode, invented in 1922 by Hughes. The basic concept of using exchange sites to create permselective membranes was used to develop other ion sensors in subsequent years. For example, a K+ sensor was produced by incorporating valinomycin into a thin membrane. In 1953, Watson and Crick announced their discovery of the now familiar double helix structure of DNA molecules and set the stage for genetics research that continues to the present day. The development of sequencing techniques in 1977 by Gilbert and Sanger (working separately) enabled researchers to directly read the genetic codes that provide instructions for protein synthesis. This research showed how hybridization of complementary single oligonucleotide strands could be used as a basis for DNA sensing. Two additional developments enabled the technology used in modern DNA based. First, in 1983 Kary Mullis invented the polymerase chain reaction (PCR) technique, thus enabling hybridization experiments to be observed optically. Figure 1 shows the make up of a typical biochip platform. The actual sensing component (or "chip") is just one piece of a complete analysis system. Transduction must be done to translate the actual sensing event (DNA binding, oxidation/reduction, etc.) into a format understandable by a computer (voltage, light intensity, mass, etc. ), which then enables additional analysis and processing to produce a final, human readable output. The multiple technologies needed to make a successful biochip—from sensing chemistry, to microarraying, to signal processing—require a true multidisciplinary approach, making the barrier to entry steep. One of the first commercial biochips was introduced by Affymetrix. Their "GeneChip" products contain thousands of individual DNA sensors for use in sensing defects, or single nucleotide polymorphisms (SNPs), in genes such as p53 (a tumor suppressor) and BRCA1 and BRCA2 (related to breast cancer). The chips are produced by using microlithography techniques traditionally used to fabricate integrated circuits (see below).

Микромассивтерді жасау

Микромассив – биосенсорлардың тығыз, екі өлшемді торы – биочип платформасының маңызды компоненті. Әдетте, сенсорлар пассивті (мысалы, кремний немесе шыны) немесе белсенді болуы мүмкін, соңғысы сигналдарды түрлендіруді орындайтын немесе көмектесетін интеграцияланған электроникадан немесе микромеханикалық құрылғылардан тұрады. Беттік химия сенсор молекулаларын субстрат ортасына ковалентті түрде байланыстыру үшін қолданылады. Микромассивтерді жасау оңай емес және болашақ биочип платформаларының табысына шешім беретін маңызды экономикалық және технологиялық кедергі болып табылады. Өндірістің басты қиындығы – әрбір сенсорды субстраттың белгілі бір орнына (әдетте, декарттық торда) орналастыру процесі. Орналастыруды жүзеге асыру үшін әртүрлі тәсілдер бар, бірақ көбінесе микропипеттеу немесе микробаспа жүйелері микрочип бетіне сенсорлық материалдың кішкентай тамшыларын орналастыру үшін қолданылады. Әрбір сенсор бірегей болғандықтан, бір уақытта бірнеше тамшы ғана орналастырылуы мүмкін. Бұл процестің төмен өнімділігі жоғары өндіріс шығындарына әкеледі. Фодор және әріптестері бірегей өндіріс процесін (кейін Affymetrix қолданды) жасады, онда микролитографиялық қадамдар сериясы бір мезгілде бір нуклеотидтен субстратқа жүздеген мыңдаған бірегей, бір тізбекті ДНК сенсорларын комбинаторлық түрде синтездеу үшін қолданылады. Бір литографиялық қадам негіздің әр түріне қажет; осылайша, нуклеотид деңгейі үшін барлығы төрт қадам қажет. Бұл әдіс көптеген сенсорларды бір уақытта жасауға мүмкіндік беретін өте қуатты болса да, қазіргі уақытта тек қысқа ДНК тізбектерін (15–25 нуклеотид) жасау үшін ғана қолданылады. Сенімділік және шығын факторлары фотолитографиялық қадамдардың санын шектейді. Сонымен қатар, ақуыздар немесе басқа сезгіш молекулалар үшін жарықпен бағытталған комбинаторлық синтез әдістері қазіргі уақытта мүмкін емес. Жоғарыда айтылғандай, көптеген микромассивтер сенсорлардың декарттық торынан тұрады. Бұл тәсіл негізінен әрбір сенсордың координатасын оның функциясымен сәйкестендіру немесе «кодтау» үшін қолданылады. Бұл массивлердегі сенсорлар көбінесе әмбебап сигнал беру әдісін қолданады (мысалы, флуоресценция), сондықтан координаталар оларды анықтаудың жалғыз белгісі болып табылады. Бұл массивтер әрбір сенсордың дұрыс орналасуын қамтамасыз ету үшін сериялық процесспен (яғни, бірнеше рет қайталама қадамдарды талап ету) жасалуы тиіс. «Кездейсоқ» жасау, онда сенсорлар чиптің кездейсоқ орындарына орналастырылады, сериялық әдіске балама болып табылады. Орналасудың қиын және қымбат процесі қажет болмайды, бұл параллельді өздігінен құрастыру әдістерін қолдануға мүмкіндік береді. Бұл тәсілмен бірдей сенсорлардың үлкен партияларын өндіруге болады; әрбір партиядан алынған сенсорлар біріктіріліп, массивке құрастырылады. Әрбір сенсорды анықтау үшін координатаға негізделмеген кодтау схемасы қолданылуы тиіс. Суретте көрсетілгендей, мұндай дизайн алғаш рет (кейін Illumina коммерцияландырды) функционалдық моншақтарды пайдаланып, ойылған оптикалық талшық кабельдің ұңғымаларына кездейсоқ орналастыру арқылы көрсетілді. Әрбір моншақ флуоресценттік белгімен ерекше кодталған. Алайда, бұл кодтау схемасы қолданылуы және сәтті ажыратылуы мүмкін бірегей бояу комбинацияларының саны бойынша шектеулі.

The microarray—the dense, two dimensional grid of biosensors—is the critical component of a biochip platform. Typically, the sensors are deposited on a flat substrate, which may either be passive (e. g. silicon or glass) or active, the latter
consisting of integrated electronics or micromechanical devices that perform or assist signal transduction. Surface chemistry is used to covalently bind the sensor molecules to the substrate medium. The fabrication of microarrays is non trivial and is a major economic and technological hurdle that may ultimately decide the success of future biochip platforms. The primary manufacturing challenge is the process of placing each sensor at a specific position (typically on a Cartesian grid) on the substrate. Various means exist to achieve the placement, but typically robotic micro pipetting or micro printing systems are used to place tiny spots of sensor material on the chip surface. Because each sensor is unique, only a few spots can be placed at a time. The low throughput nature of this
process results in high manufacturing costs. Fodor and colleagues developed a unique fabrication process (later used by Affymetrix) in which a series of microlithography steps is used to combinatorially synthesize hundreds of thousands of unique, single stranded DNA sensors on a substrate one nucleotide at a time. One lithography step is needed per base type; thus, a total of four steps is required per nucleotide level. Although this technique is very powerful in that many sensors can be created simultaneously, it is currently only feasible for creating short DNA strands (15–25 nucleotides). Reliability and cost factors limit the number of photolithography steps that can be done. Furthermore, light directed combinatorial synthesis techniques are not currently possible for proteins or other sensing molecules. As noted above, most microarrays consist of a Cartesian grid of sensors. This approach is used chiefly to map or "encode" the coordinate of each sensor to its function. Sensors in these arrays typically use a universal signalling technique (e. g. fluorescence), thus making coordinates their only identifying feature. These arrays must be made using a serial process (i. e. requiring multiple, sequential steps) to ensure that each sensor is placed at the correct position. "Random" fabrication, in which the sensors are placed at arbitrary positions on the chip, is an alternative to the serial method. The tedious and expensive positioning process is
not required, enabling the use of parallelized self assembly techniques. In this approach, large batches of identical sensors can be produced; sensors from each batch are then combined and assembled into an array. A non coordinate based encoding scheme must be used to identify each sensor. As the figure shows, such a design was first demonstrated (and later commercialized by Illumina) using functionalized beads placed randomly in the wells of an etched fiber optic cable. Each bead was uniquely encoded with a fluorescent signature. However, this encoding scheme is limited in the number of unique dye combinations that can be used and successfully differentiated.

Белок биочиптері мен басқа микрочиптер технологиялары

Микроаррейлер ДНК талдауымен ғана шектелмейді; биочиптерді пайдалану арқылы ақуыз микроаррейлері, антидене микроаррейлері, химиялық қосылыстар микроаррейлері де жасалуы мүмкін. 2003 жылы Randox Laboratories Ltd. компаниясы Evidence – алғашқы ақуызды биочиптік массивтік технологияны талдайтын құралды ұсынды. Ақуызды биочиптік массивтік технологиясында биочип реакциялық платформа ретінде ELISA пластинасын немесе кюветті алмастырады. Биочип бір үлгідегі байланысты сынақтардың жиынтығын бір мезгілде талдау үшін қолданылады, нәтижесінде пациенттің профилі құрылады. Пациент профилі ауруды анықтау, диагностикалау, аурудың прогрессиясын қадағалау немесе емдеуді бақылау үшін қолданылуы мүмкін. Бірнеше талдауды бір уақытта жүргізу, мультиплекстеу деп аталады, бұл өңдеу уақытын және қажетті пациент үлгісінің мөлшерін айтарлықтай қысқартуға мүмкіндік береді. Биочиптік массивтік технология – бұл таныс әдістеменің жаңа қолданылуы, онда сэндвич, бәсекелестік және антиденелерді ұстау иммуноанализдері қолданылады. Дәстүрлі иммуноанализдерден айырмашылығы, тұтқындау лигандтары ерітіндіде емес, реттелген массивте биочип бетіне ковалентті байланыс арқылы бекітіледі. Сэндвич-тесттерде фермент таңбасы қойылған антидене, ал бәсекелестік тесттерде фермент таңбасы қойылған антиген қолданылады. Антидене антигенмен байланысқанда, люминесценциялық реакция жарық шығарады. Анықтау зарядтық байланыс құрылғысы (CCD) камерасы арқылы жүзеге асырылады. CCD камерасы – бұл өте төмен жарық деңгейін дәл анықтап, өлшеуге қабілетті, сезімтал және жоғары ажыратымды сенсор. Сынақ аймақтары торлы үлгі бойынша анықталады, содан кейін люминесценциялық сигналдар бейнелеу бағдарламалық жасақтамасы арқылы жеке аналиттерді жылдам және бір мезгілде мөлшерлеу үшін талданады. Биочиптер микрофизиометрия саласында да қолданылады, мысалы, «тері чипі» қолданбаларында. Басқа массивтік технологиялар туралы толық мәліметтерді «Антидене микроаррейі» бетінен қараңыз.