Биочипы: Субстраты для биохимических реакций и перспективы применения.

Введение

Подложки, осуществляющие биохимические реакции

В молекулярной биологии биочипы – это специально разработанные подложки («миниатюрные лаборатории»), способные поддерживать проведение большого числа одновременных биохимических реакций. Одной из целей технологии биочипов является эффективный скрининг большого количества биологических аналитов, с потенциальными областями применения от диагностики заболеваний до обнаружения агентов биологического терроризма. Например, цифровые микрофлюидные биочипы исследуются для применения в биомедицинской сфере. В цифровом микрофлюидном биочипе группа (смежных) ячеек в микрофлюидном массиве может быть сконфигурирована для выполнения функций хранения, осуществления функциональных операций, а также для динамической транспортировки капель жидкости.

История

Разработка началась с ранних работ над базовой сенсорной технологией. Одним из первых портативных датчиков, основанных на химических принципах, был стеклянный pH-электрод, изобретенный Хьюзом в 1922 году. Базовая концепция использования обменных центров для создания пермселективных мембран была использована для разработки других ионных датчиков в последующие годы. Например, датчик K+ был создан путем включения валиномицина в тонкую мембрану. В 1953 году Уотсон и Крик объявили об открытии хорошо известной структуры ДНК в виде двойной спирали, что заложило основу для генетических исследований, продолжающихся и по сей день. Разработка методов секвенирования в 1977 году Гилбертом и Сангером (работавшими независимо) позволила исследователям непосредственно считывать генетические коды, содержащие инструкции для синтеза белков. Это исследование показало, что гибридизация комплементарных одноцепочечных олигонуклеотидов может быть использована в качестве основы для обнаружения ДНК. Два дополнительных достижения сделали возможным использование технологии, лежащей в основе современной ДНК-диагностики. Во-первых, в 1983 году Кари Муллис изобрел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), что позволило оптически наблюдать за экспериментами по гибридизации. На рисунке 1 представлена структура типичной биочиповой платформы. Фактический сенсорный компонент (или "чип") – это лишь часть полной аналитической системы. Необходима трансдукция для преобразования события сенсоринга (связывание ДНК, окисление/восстановление и т.д.) в формат, понятный компьютеру (напряжение, интенсивность света, масса и т.д.), что позволяет проводить дальнейший анализ и обработку для получения конечного результата, читаемого человеком. Многочисленные технологии, необходимые для создания успешного биочипа – от сенсорной химии до микромассирования и обработки сигналов – требуют комплексного междисциплинарного подхода, что создает значительные барьеры для входа на рынок. Одним из первых коммерческих биочипов был представлен компанией Affymetrix. Их продукты "GeneChip" содержат тысячи отдельных ДНК-датчиков для обнаружения дефектов или однонуклеотидных полиморфизмов (СНП) в генах, таких как p53 (ген-супрессор опухоли) и BRCA1 и BRCA2 (связанные с раком молочной железы). Чипы производятся с использованием методов микролитографии, традиционно применяемых для изготовления интегральных схем (см. ниже).

The development started with early work on the underlying sensor technology. One of the first portable, chemistry based sensors was the glass pH electrode, invented in 1922 by Hughes. The basic concept of using exchange sites to create permselective membranes was used to develop other ion sensors in subsequent years. For example, a K+ sensor was produced by incorporating valinomycin into a thin membrane. In 1953, Watson and Crick announced their discovery of the now familiar double helix structure of DNA molecules and set the stage for genetics research that continues to the present day. The development of sequencing techniques in 1977 by Gilbert and Sanger (working separately) enabled researchers to directly read the genetic codes that provide instructions for protein synthesis. This research showed how hybridization of complementary single oligonucleotide strands could be used as a basis for DNA sensing. Two additional developments enabled the technology used in modern DNA based. First, in 1983 Kary Mullis invented the polymerase chain reaction (PCR) technique, thus enabling hybridization experiments to be observed optically. Figure 1 shows the make up of a typical biochip platform. The actual sensing component (or "chip") is just one piece of a complete analysis system. Transduction must be done to translate the actual sensing event (DNA binding, oxidation/reduction, etc.) into a format understandable by a computer (voltage, light intensity, mass, etc. ), which then enables additional analysis and processing to produce a final, human readable output. The multiple technologies needed to make a successful biochip—from sensing chemistry, to microarraying, to signal processing—require a true multidisciplinary approach, making the barrier to entry steep. One of the first commercial biochips was introduced by Affymetrix. Their "GeneChip" products contain thousands of individual DNA sensors for use in sensing defects, or single nucleotide polymorphisms (SNPs), in genes such as p53 (a tumor suppressor) and BRCA1 and BRCA2 (related to breast cancer). The chips are produced by using microlithography techniques traditionally used to fabricate integrated circuits (see below).

Изготовление микромассивов

Микромассив — плотная двумерная сетка биосенсоров — является критически важным компонентом платформы биочипа. Обычно датчики наносятся на плоскую подложку, которая может быть как пассивной (например, кремний или стекло), так и активной, последняя из которых содержит встроенную электронику или микромеханические устройства, выполняющие или облегчающие передачу сигнала. Поверхностная химия используется для ковалентного связывания молекул датчика со средой подложки. Изготовление микромассивов — непростая задача и является серьезным экономическим и технологическим препятствием, которое в конечном итоге может определить успех будущих платформ биочипов. Основная производственная задача — процесс размещения каждого датчика в определенной позиции (обычно на декартовой сетке) на подложке. Существуют различные способы достижения этого размещения, но обычно для нанесения крошечных пятен сенсорного материала на поверхность чипа используются роботизированные микропипетки или микропечатные системы. Поскольку каждый датчик уникален, одновременно можно разместить лишь несколько пятен. Невысокая производительность этого процесса приводит к высоким производственным затратам. Фодор и его коллеги разработали уникальный процесс изготовления (позже использованный Affymetrix), в котором серия этапов микролитографии используется для комбинаторного синтеза сотен тысяч уникальных одноцепочечных ДНК-датчиков на подложке, по одному нуклеотиду за раз. Для каждого типа основания требуется один литографический этап; таким образом, требуется в общей сложности четыре этапа на каждый нуклеотидный уровень. Хотя этот метод очень эффективен, поскольку позволяет одновременно создавать множество датчиков, в настоящее время он применим только для создания коротких фрагментов ДНК (15–25 нуклеотидов). Факторы надежности и стоимости ограничивают количество этапов фотолитографии, которые можно выполнить. Кроме того, методы комбинаторного синтеза, направленные на световой сигнал, в настоящее время невозможны для белков или других сенсорных молекул. Как отмечалось выше, большинство микромассивов состоят из декартовой сетки датчиков. Этот подход используется главным образом для сопоставления или «кодирования» координат каждого датчика с его функцией. Датчики в этих массивах обычно используют универсальную технику сигнализации (например, флуоресценцию), что делает координаты их единственной идентифицирующей характеристикой. Эти массивы должны изготавливаться последовательным процессом (то есть требующим нескольких последовательных этапов), чтобы гарантировать, что каждый датчик будет помещен в правильное положение. «Случайное» изготовление, при котором датчики размещаются в произвольных позициях на чипе, является альтернативой последовательному методу. Тщательный и дорогостоящий процесс позиционирования не требуется, что позволяет использовать параллельные методы самосборки. При этом можно производить большие партии идентичных датчиков; датчики из каждой партии затем объединяются и собираются в массив. Для идентификации каждого датчика должна использоваться схема кодирования, не основанная на координатах. Как показано на рисунке, такая конструкция была впервые продемонстрирована (а позже коммерциализирована Illumina) с использованием функционализированных бусин, случайным образом помещенных в лунки травленого оптоволоконного кабеля. Каждая бусина была уникально закодирована флуоресцентной сигнатурой. Однако эта схема кодирования ограничена количеством уникальных комбинаций красителей, которые можно использовать и успешно дифференцировать.

The microarray—the dense, two dimensional grid of biosensors—is the critical component of a biochip platform. Typically, the sensors are deposited on a flat substrate, which may either be passive (e. g. silicon or glass) or active, the latter
consisting of integrated electronics or micromechanical devices that perform or assist signal transduction. Surface chemistry is used to covalently bind the sensor molecules to the substrate medium. The fabrication of microarrays is non trivial and is a major economic and technological hurdle that may ultimately decide the success of future biochip platforms. The primary manufacturing challenge is the process of placing each sensor at a specific position (typically on a Cartesian grid) on the substrate. Various means exist to achieve the placement, but typically robotic micro pipetting or micro printing systems are used to place tiny spots of sensor material on the chip surface. Because each sensor is unique, only a few spots can be placed at a time. The low throughput nature of this
process results in high manufacturing costs. Fodor and colleagues developed a unique fabrication process (later used by Affymetrix) in which a series of microlithography steps is used to combinatorially synthesize hundreds of thousands of unique, single stranded DNA sensors on a substrate one nucleotide at a time. One lithography step is needed per base type; thus, a total of four steps is required per nucleotide level. Although this technique is very powerful in that many sensors can be created simultaneously, it is currently only feasible for creating short DNA strands (15–25 nucleotides). Reliability and cost factors limit the number of photolithography steps that can be done. Furthermore, light directed combinatorial synthesis techniques are not currently possible for proteins or other sensing molecules. As noted above, most microarrays consist of a Cartesian grid of sensors. This approach is used chiefly to map or "encode" the coordinate of each sensor to its function. Sensors in these arrays typically use a universal signalling technique (e. g. fluorescence), thus making coordinates their only identifying feature. These arrays must be made using a serial process (i. e. requiring multiple, sequential steps) to ensure that each sensor is placed at the correct position. "Random" fabrication, in which the sensors are placed at arbitrary positions on the chip, is an alternative to the serial method. The tedious and expensive positioning process is
not required, enabling the use of parallelized self assembly techniques. In this approach, large batches of identical sensors can be produced; sensors from each batch are then combined and assembled into an array. A non coordinate based encoding scheme must be used to identify each sensor. As the figure shows, such a design was first demonstrated (and later commercialized by Illumina) using functionalized beads placed randomly in the wells of an etched fiber optic cable. Each bead was uniquely encoded with a fluorescent signature. However, this encoding scheme is limited in the number of unique dye combinations that can be used and successfully differentiated.

Технологии массивов белковых биочипов и других микромассивов

Микромассивы не ограничиваются анализом ДНК; также могут быть созданы микромассивы белков, микромассивы антител и микромассивы химических соединений с использованием биочипов. Randox Laboratories Ltd. представила Evidence, первый анализатор на основе технологии Biochip Array Technology для анализа белков, в 2003 году. В технологии белковых биочипов биочип заменяет планшеты или кюветы ELISA в качестве реакционной платформы. Биочип используется для одновременного анализа панели связанных тестов в одном образце, что позволяет получить профиль пациента. Этот профиль пациента может быть использован для скрининга заболеваний, диагностики, мониторинга прогрессирования заболевания или контроля эффективности лечения. Одновременное выполнение нескольких анализов, известное как мультиплексирование, значительно сокращает время обработки и объем необходимого образца пациента. Технология биочипов – это новое применение хорошо известной методологии, использующее иммуноанализы сэндвич-типа, конкурентные иммуноанализы и иммуноанализы с захватом антител. Отличие от традиционных иммуноанализов заключается в том, что лиганды захвата ковалентно прикреплены к поверхности биочипа в упорядоченном массиве, а не находятся в растворе. В сэндвич-анализах используется антитело, меченное ферментом, а в конкурентных – антиген, меченный ферментом. При связывании антигена с антителом происходит химиолюминесцентная реакция, излучающая свет. Детекция осуществляется с помощью камеры с зарядовой связью (CCD). CCD-камера – это высокочувствительный и высокоразрешающий сенсор, способный точно обнаруживать и количественно определять очень низкие уровни света. Тестовые области определяются с помощью сетчатого рисунка, после чего химиолюминесцентные сигналы анализируются с помощью программного обеспечения для быстрого и одновременного количественного определения отдельных аналитов. Биочипы также используются в области микрофизиометрии, например, в приложениях типа «кожа на чипе». Подробную информацию о других технологиях массивов см. в разделе «Микромассив антител».