Жақындық Химиялық Қосылу: Үлкен Пептидтерді және Ақуыздарды Синтездеу Әдісі
Native chemical ligation
Жаңа химиялық байланыс (NCL) – бұл пептидтерді біріктіріп, күрделі белоктарды (~300 АА дейін) жасаудың тиімді әдісі. Химиялық және туастамалық байланыс туралы біліңіз.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Туған химиялық лигация (NCL) – екі немесе одан көп қорғалмаған пептид сегменттерін коваленттік конденсация арқылы үлкен полипептидтік тізбек құруға арналған химиялық лигация тұжырымдамасының маңызды кеңейтілген түрі. Табиғи химиялық лигация – қалыпты мөлшердегі (яғни, ~300 АА-ден кіші ақуыздар) табиғи немесе өзгертілген ақуыздарды синтездеудің ең тиімді әдісі.
Native Chemical Ligation (NCL) is an important extension of the chemical ligation concept for constructing a larger polypeptide chain by the covalent condensation of two or more unprotected peptides segments. Native chemical ligation is the most effective method for synthesizing native or modified proteins of typical size (i. e., proteins< ~300 AA).
Тарихи контекст
1992 жылы Стивен Кент пен Мартина Шнольцер Скриппс ғылыми-зерттеу институтында "Химиялық лигация" концепциясын, қорғалмаған пептидтік сегменттерді коваленттік тұрғыда біріктірудің алғашқы практикалық әдісін жасады; химиялық лигацияның басты ерекшелігі – лигация орнында табиғи емес байланыстың қалыптасуы. Екі жыл өткен соң, 1994 жылы Филип Доусон, Том Мьюр және Стивен Кент "Тұрғын химиялық лигация" туралы хабарлады, бұл химиялық лигация концепциясын кеңейту болды, мұнда бастапқы нуклеофильдік конденсациядан кейін туынды амид ('пептид') байланысы пайда болды. Теодор Виланд және оның әріптестері S-тен N-ге ацил тобының ауысуы туралы 1953 жылы хабарлаған, валин тиоэстері мен цистеин аминқышқылының сулы буфердегі реакциясы валин-цистеин дипептидін беретінін көрсеткен. Реакция цистеин қалдығының күкірті бар тиоэстер арқылы өтті. Дегенмен, Виландтың жұмысы тұрғын химиялық лигация реакциясын дамытуға әкелмеді. Керісінше, аминқышқылы тиоэстерлерінің реакцияларын зерттеу Виландты және басқаларды қорғалған пептидтік сегменттерді органикалық еріткіштерде жүзеге асырылатын дәстүрлі химиялық әдістермен синтездеу үшін "белсенді эфир" әдісін жасауға бағыттады.
In 1992, Stephen Kent and Martina Schnölzer at The Scripps Research Institute developed the "Chemical Ligation" concept, the first practical method to covalently condense unprotected peptide segments; the key feature of chemical ligation is formation of an unnatural bond at the ligation site. Just two years later in 1994, Philip Dawson, Tom Muir and Stephen Kent reported "Native Chemical Ligation", an extension of the chemical ligation concept to the formation of a native amide ('peptide') bond after initial nucleophilic condensation formed a thioester linked condensation product designed to spontaneously rearrange to the native amide bond at the ligation site. Theodor Wieland and coworkers had reported the S to N acyl shift as early as 1953, when the reaction of valine thioester and cysteine amino acid in aqueous buffer was shown to yield the dipeptide valine cysteine. The reaction proceeded through the intermediacy of a thioester containing the sulfur of the cysteine residue. However, Wieland's work did NOT lead to the development of the native chemical ligation reaction. Rather, the study of amino acid thioester reactions led Wieland and others to develop the 'active ester' method for the synthesis of protected peptide segments by conventional chemical methods carried out in organic solvents.
Ерекшеліктері
Табиғи химиялық лигация қазіргі заманғы химиялық белок синтезінің негізін құрайды және көптеген белоктар мен ферменттерді толық химиялық синтез арқылы дайындау үшін қолданылады. Туған химиялық лигация әдісінің артықшылығы – бұл әдіспен ұзын пептидтерді біріктіру көбінесе сандыққа жақын болады және олардың үлкен өлшемдеріне, трансляциядан кейінгі модификациялармен әшекейленуіне және кодталмаған аминқышқылдары немесе басқа химиялық құрылымдық элементтерді қамтитындықтан, әйтпесе жасау мүмкін болмайтын үлкен пептидтер мен белоктарға синтетикалық қолжетімділікті қамтамасыз етеді. Табиғи химиялық лигация атомдық экономикасы және қауіпсіз еріткіштерді пайдалану тұрғысынан «жасыл» болып табылады. Ол қорғалмаған пептидтің тиоэстерінің екінші, қорғалмаған пептидпен, N-терминалында цистеин қалдығы бар реакциясын қамтиды. Бұл реакция бейтарап pH-тағы сулы ерітіндіде, әдетте 6 М гуанидин гидрохлоридінде, арилтиол катализаторының қатысуымен жүргізіледі және қажетті лигация өнімінің шамамен бірдей мөлшерін береді. Пептидтік тиоэстерлерді тікелей Boc химиясы SPPS арқылы дайындауға болады; алайда тиоэстерді қамтитын пептидтер нуклеофилдік негіздермен өңдеуге тұрақты емес, сондықтан Fmoc химиясы SPPS арқылы пептидтік тиоэстерлерді тікелей синтездеуге болмайды. Fmoc химиясының қатты фазалық пептид синтезінің әдістері пептидтік тиоэстерлерді жасау үшін пептидтік гидразидтерді синтездеуге негізделген, олар синтезден кейін пептидтік тиоэстерлерге айналады. Полипептидтік C-терминалды тиоэстерлерді N,S-ацилдік ауысу жүйелерін пайдалана отырып, in situ жағдайында да өндіруге болады. Bis((2-сульфанил)этил)амид тобы, сондай-ақ SEA тобы деп аталатын, осы отбасыға жатады. Полипептидтік C-терминалды bis((2-сульфанилэтил)амидтер) (SEA пептид сегменттері) Cys пептидімен әрекеттесіп, NCL-дегідей пептидтік байланыс түзетіп, туынды пептидтік байланыс береді. Бұл реакция SEA Native Peptide Ligation деп аталады және ол туған химиялық лигацияның пайдалы нұсқасы болып табылады. N-терминалды цистеин қалдығын қамтитын пептид сегменттерін жасау кезінде кетондарға ұшыраудан аулақ болу керек, өйткені олар N-терминалды цистеиннің қақпағын жаба алады. Альдегидтер мен кетондарды бөліп шығаратын қорғаушы топтарды қолданбаңыз. Осы себепті, әсіресе лиофилизация үшін қолданылатын шыны ыдыстарды жууда ацетонды пайдаланудан аулақ болу керек. Табиғи химиялық лигация әдісінің ерекшелігі – өнім полипептидтік тізбегінде лигация орнында цистеиннің болуы. Лигация орнындағы цистеин аланинге дейін десульфуриленуі мүмкін, бұл аланин қалдықтарын қосу үшін мүмкін лигация орындарының ауқымын кеңейтеді. Басқа бета-тиолды қамтитын аминқышқылдарды туған химиялық лигация үшін де қолдануға болады, содан кейін десульфуриленуге болады. Сонымен қатар, синтезден кейін алынып тасталатын, бірақ N-терминалды цистеиннің орнын басатын тиолды қамтитын лигациялық көмекші заттарды қолдануға болады. Тиолды қамтитын көмекші заттарды қолдану Cys қалдықтарындағы лигация сияқты тиімді болмауы мүмкін. Табиғи химиялық лигация N-терминалды селеноцистеин қалдығымен де жүргізілуі мүмкін. Рекомбинантты ДНҚ әдістерімен өндірілген полипептидтік C-терминалды тиоэстерлерді сол туған лигациялық химия арқылы N-терминалды Cys-ты қамтитын полипептидпен реакцияға түсіріп, өте үлкен жартылай синтетикалық белоктар алуға болады. Осы түрдегі туған химиялық лигация, рекомбинантты полипептид сегментін пайдаланатын, Экспресстелген белок лигациясы деп аталады. Сол сияқты, N-терминалды Cys-ты қамтитын рекомбинантты белок синтетикалық полипептидтік тиоэстермен реакцияға түседі. Осылайша, табиғи химиялық лигация химиялық синтезделген сегменттерді рекомбинантты белоктарға олардың мөлшеріне қарамастан енгізу үшін қолданылуы мүмкін.
Native chemical ligation forms the basis of modern chemical protein synthesis, and has been used to prepare numerous proteins and enzymes by total chemical synthesis. The payoff in the native chemical ligation method is that coupling long peptides by this technique is typically near quantitative and provides synthetic access to large peptides and proteins otherwise impossible to make, due to their large size, decoration by post translational modification, and containing non coded amino acid or other chemical building blocks. Native chemical ligation is inherently 'Green' in its atom economy and its use of benign solvents. It involves the reaction of an unprotected peptide thioester with a second, unprotected peptide that has an N terminal cysteine residue. It is carried out in aqueous solution at neutral pH, usually in 6 M guanidine. hydrochloride, in the presence of an arylthiol catalyst and typically gives near quantitative yields of the desired ligation product. Peptide thioesters can be directly prepared by Boc chemistry SPPS; however, thioester containing peptides are not stable to treatment with a nucleophilic base, thus preventing direct synthesis of peptide thioesters by Fmoc chemistry SPPS. Fmoc chemistry solid phase peptide synthesis techniques for generating peptide thioesters are based on the synthesis of peptide hydrazides that are converted to peptide thioesters post synthetically. Polypeptide C terminal thioesters can also be produced in situ, using so called N,S acyl shift systems. Bis(2 sulfanylethyl)amido group, also called SEA group, belongs to this family. Polypeptide C terminal bis(2 sulfanylethyl)amides (SEA peptide segments) react with Cys peptide to give a native peptide bond as in NCL. This reaction, which is called SEA Native Peptide Ligation, is a useful variant of native chemical ligation. In making peptide segments that contain an N terminal cysteine residue, exposure to ketones should be avoided since these may cap the N terminal cysteine. Do not use protecting groups that release aldehydes or ketones. For the same reason, the use of acetone should be avoided, particularly in washing glassware used for lyophilization. A feature of the native chemical ligation technique is that the product polypeptide chain contains cysteine at the site of ligation. The cysteine at the ligation site can be desulfurized to alanine, thus extending the range of possible ligation sites to include alanine residues. Other beta thiol containing amino acids can be used for native chemical ligation, followed by desulfurization. Alternatively, thiol containing ligation auxiliaries can be used that mimic an N terminal cysteine for the ligation reaction, but which can be removed after synthesis. The use of thiol containing auxiliaries may not be as effective as ligation at a Cys residue. Native chemical ligation can also be performed with an N terminal selenocysteine residue. Polypeptide C terminal thioesters produced by recombinant DNA techniques can be reacted with an N terminal Cys containing polypeptide by the same native ligation chemistry to provide very large semi synthetic proteins. Native chemical ligation of this kind using a recombinant polypeptide segment is known as Expressed Protein Ligation. Similarly, a recombinant protein containing an N terminal Cys can be reacted with a synthetic polypeptide thioester. Thus, native chemical ligation can be used to introduce chemically synthesized segments into recombinant proteins, regardless of size.