Нативная химическая лигация: синтез больших пептидов и белков.

Введение

Нативная химическая лигация (НХЛ) — важное расширение концепции химической лигации, используемое для построения более длинной полипептидной цепи посредством ковалентной конденсации двух или более незащищенных пептидных фрагментов. Нативная химическая лигация является наиболее эффективным методом синтеза нативных или модифицированных белков обычного размера (то есть белков < ~300 аминокислот).

Исторический контекст

В 1992 году Стивен Кент и Мартина Шнольцер из Исследовательского института Скриппса разработали концепцию "химической лигации" – первый практический метод ковалентного соединения незащищенных пептидных фрагментов. Ключевой особенностью химической лигации является формирование неестественной связи в месте лигации. Всего через два года, в 1994 году, Филипп Доусон, Том Мьюр и Стивен Кент представили "нативную химическую лигацию" – расширение концепции химической лигации, позволяющее формировать нативную амидную ('пептидную') связь после первоначальной нуклеофильной конденсации, образующей тиоэфирный продукт конденсации, предназначенный для спонтанной перегруппировки в нативную амидную связь в месте лигации. Теодор Виланд и его коллеги сообщили о переходе S-ацильной группы в N-ацильную еще в 1953 году, когда было показано, что реакция тиоэстера валина и аминокислоты цистеина в водном буфере приводит к образованию дипептида валин-цистеин. Реакция протекала через промежуточное образование тиоэстера, содержащего серу цистеинового остатка. Однако работа Виланда НЕ привела к разработке реакции нативной химической лигации. Скорее, изучение реакций тиоэфиров аминокислот привело Виланда и других к разработке метода "активных эфиров" для синтеза защищенных пептидных фрагментов с использованием традиционных химических методов, проводимых в органических растворителях.

Особенности

Нативная химическая лигация лежит в основе современного химического синтеза белков и используется для получения многочисленных белков и ферментов полным химическим синтезом. Преимущество метода нативной химической лигации заключается в том, что соединение длинных пептидов с помощью этой техники обычно происходит почти количественно и обеспечивает синтетический доступ к большим пептидам и белкам, которые иным образом было бы невозможно получить из-за их большого размера, посттрансляционных модификаций, наличия некодирующих аминокислот или других химических строительных блоков. Нативная химическая лигация по своей сути является экологически безопасной благодаря своей атомной экономии и использованию мягких растворителей. Она включает в себя реакцию незащищенного пептидного тиоэстера со вторым незащищенным пептидом, содержащим N-концевой остаток цистеина. Реакция проводится в водном растворе при нейтральном pH, обычно в 6 М растворе гуанидина гидрохлорида, в присутствии арилтиольного катализатора и обычно дает почти количественный выход целевого продукта лигации. Пептидные тиоэстеры могут быть непосредственно получены с помощью Boc-химии SPPS; однако пептиды, содержащие тиоэстер, нестабильны при обработке нуклеофильным основанием, что препятствует прямому синтезу пептидных тиоэстеров с помощью Fmoc-химии SPPS. Методы твердофазного синтеза пептидов для получения пептидных тиоэстеров основаны на синтезе пептидных гидразидов, которые постсинтетически превращаются в пептидные тиоэстеры. Полипептидные C-концевые тиоэстеры также могут быть получены in situ с использованием так называемых N,S-ацилсдвиговых систем. Bis(2-сульфанилэтил)амидная группа, также известная как SEA-группа, относится к этому семейству. Полипептидные C-концевые bis(2-сульфанилэтил)амиды (пептидные сегменты SEA) реагируют с пептидом, содержащим цистеин, с образованием нативной пептидной связи, как в NCL. Эта реакция, называемая SEA-нативной пептидной лигацией, является полезным вариантом нативной химической лигации. При создании пептидных сегментов, содержащих N-концевой остаток цистеина, следует избегать контакта с кетонами, поскольку они могут блокировать N-концевой цистеин. Не используйте защитные группы, высвобождающие альдегиды или кетоны. По той же причине следует избегать использования ацетона, особенно при промывке стеклянной посуды, используемой для лиофилизации. Особенностью метода нативной химической лигации является то, что полипептидная цепь продукта содержит цистеин в месте лигации. Цистеин в месте лигации может быть десульфурирован до аланина, тем самым расширяя диапазон возможных мест лигации, включая остатки аланина. Другие бета-тиолсодержащие аминокислоты могут быть использованы для нативной химической лигации с последующей десульфуризацией. В качестве альтернативы можно использовать тиолсодержащие вспомогательные группы, имитирующие N-концевой цистеин для реакции лигации, но которые могут быть удалены после синтеза. Использование тиолсодержащих вспомогательных групп может быть не таким эффективным, как лигация на остатке цистеина. Нативная химическая лигация также может быть выполнена с N-концевым остатком селеноцистеина. Полипептидные C-концевые тиоэстеры, полученные методами рекомбинантной ДНК, могут быть прореагированы с N-концевым полипептидом, содержащим цистеин, с использованием той же нативной химии лигации для получения очень больших полусинтетических белков. Такой тип нативной химической лигации с использованием рекомбинантного полипептидного сегмента известен как экспрессированная лигация белков. Аналогично, рекомбинантный белок, содержащий N-концевой цистеин, может быть прореагирован с синтетическим полипептидным тиоэстером. Таким образом, нативная химическая лигация может быть использована для введения химически синтезированных сегментов в рекомбинантные белки, независимо от их размера.

Native chemical ligation forms the basis of modern chemical protein synthesis, and has been used to prepare numerous proteins and enzymes by total chemical synthesis. The payoff in the native chemical ligation method is that coupling long peptides by this technique is typically near quantitative and provides synthetic access to large peptides and proteins otherwise impossible to make, due to their large size, decoration by post translational modification, and containing non coded amino acid or other chemical building blocks. Native chemical ligation is inherently 'Green' in its atom economy and its use of benign solvents. It involves the reaction of an unprotected peptide thioester with a second, unprotected peptide that has an N terminal cysteine residue. It is carried out in aqueous solution at neutral pH, usually in 6 M guanidine. hydrochloride, in the presence of an arylthiol catalyst and typically gives near quantitative yields of the desired ligation product. Peptide thioesters can be directly prepared by Boc chemistry SPPS; however, thioester containing peptides are not stable to treatment with a nucleophilic base, thus preventing direct synthesis of peptide thioesters by Fmoc chemistry SPPS. Fmoc chemistry solid phase peptide synthesis techniques for generating peptide thioesters are based on the synthesis of peptide hydrazides that are converted to peptide thioesters post synthetically. Polypeptide C terminal thioesters can also be produced in situ, using so called N,S acyl shift systems. Bis(2 sulfanylethyl)amido group, also called SEA group, belongs to this family. Polypeptide C terminal bis(2 sulfanylethyl)amides (SEA peptide segments) react with Cys peptide to give a native peptide bond as in NCL. This reaction, which is called SEA Native Peptide Ligation, is a useful variant of native chemical ligation. In making peptide segments that contain an N terminal cysteine residue, exposure to ketones should be avoided since these may cap the N terminal cysteine. Do not use protecting groups that release aldehydes or ketones. For the same reason, the use of acetone should be avoided, particularly in washing glassware used for lyophilization. A feature of the native chemical ligation technique is that the product polypeptide chain contains cysteine at the site of ligation. The cysteine at the ligation site can be desulfurized to alanine, thus extending the range of possible ligation sites to include alanine residues. Other beta thiol containing amino acids can be used for native chemical ligation, followed by desulfurization. Alternatively, thiol containing ligation auxiliaries can be used that mimic an N terminal cysteine for the ligation reaction, but which can be removed after synthesis. The use of thiol containing auxiliaries may not be as effective as ligation at a Cys residue. Native chemical ligation can also be performed with an N terminal selenocysteine residue. Polypeptide C terminal thioesters produced by recombinant DNA techniques can be reacted with an N terminal Cys containing polypeptide by the same native ligation chemistry to provide very large semi synthetic proteins. Native chemical ligation of this kind using a recombinant polypeptide segment is known as Expressed Protein Ligation. Similarly, a recombinant protein containing an N terminal Cys can be reacted with a synthetic polypeptide thioester. Thus, native chemical ligation can be used to introduce chemically synthesized segments into recombinant proteins, regardless of size.