Точқалы ПТР (touchdown PCR) әдісі – ДНК-ны теңіздік емес тізбектерден таза күйінде амплификациялауға көмектеседі. Примерлердің температурасын баптау арқылы нақтылықты арттыру.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Кіріспе
Тейчдаун полимераза тізбекті реакциясы немесе тейчдаун стиліндегі полимераза тізбекті реакциясы – полимераза тізбекті реакциясының әдісі, онда праймерлер ерекше емес тізбектерді күшейтуден аулақ болады. Полимераза тізбекті реакциясы кезіндегі оттестіру температурасы праймердің оттестіру ерекшелігін анықтайды. Праймердің балқу температурасы оттестіру температурасының жоғарғы шегін белгілейді. Осы температурадан сәл жоғарыда праймер мен матрица арасында өте ерекше базалық жұптасу ғана жүреді. Төмен температурада праймерлер аз ерекшеленеді. Ерекше емес праймерлік байланыс полимераза тізбекті реакциясының нәтижелерін бұрмалайды, себебі полимераза күшейтуінің экспоненциалды сипатына байланысты, күшейтудің бастапқы кезеңдерінде праймерлерге байланысатын ерекше емес тізбектер кез келген ерекше тізбектерді басып кетеді.
The touchdown polymerase chain reaction or touchdown style polymerase chain reaction is a method of polymerase chain reaction by which primers avoid amplifying nonspecific sequences. The annealing temperature during a polymerase chain reaction determines the specificity of primer annealing. The melting point of the primer sets the upper limit on annealing temperature. At temperatures just above this point, only very specific base pairing between the primer and the template will occur. At lower temperatures, the primers bind less specifically. Nonspecific primer binding obscures polymerase chain reaction results, as the nonspecific sequences to which primers anneal in early steps of amplification will "swamp out" any specific sequences because of the exponential nature of polymerase amplification.
Әдіс
Полимераза тізбекті реакциясы циклінің бастапқы қадамдары жоғары қайтадан қыздыру температурасына ие. Әрбір келесі цикл жиыны үшін қайтадан қыздыру температурасы бірте-бірте төмендетіледі. Праймер, оған төзімді болатын ең аз ерекше емес байланысқа рұқсат ететін ең жоғары температурада байланысады. Осылайша, алғаш күшейтілген тізбек – ең үлкен праймер ерекшелігіне ие аймақтар арасындағы тізбек; бұл, ең болжанатын, қызығушылық тудыратын тізбек. Бұл фрагменттер келесі турларда төмен температурада одан әрі күшейтіледі және праймерлер сол төмен температурада байланысатын ерекше емес тізбектерден басым түседі. Егер праймер бастапқыда (жоғары температуралы фазаларда) қызығушылық тудыратын тізбекке байланысса, онда осы фрагменттерді одан әрі күшейту үшін өнімге полимераза тізбекті реакциясының келесі кезеңдерін жүргізуге болады. Touchdown жоғары температурада реакцияның ерекшелігін арттырады және қайтадан қыздыру температурасын төмендету арқылы тиімділігін арттырады. Математикалық тұрғыдан алғанда, төмен температурада қайтадан қыздырылған өнімдер циклдегі бірінші қайтадан қыздыру үшін және циклдегі екінші қайтадан қыздыру үшін бұрыс болады.
The earliest steps of a touchdown polymerase chain reaction cycle have high annealing temperatures. The annealing temperature is decreased in increments for every subsequent set of cycles. The primer will anneal at the highest temperature which is least permissive of nonspecific binding that it is able to tolerate. Thus, the first sequence amplified is the one between the regions of greatest primer specificity; it is most likely that this is the sequence of interest. These fragments will be further amplified during subsequent rounds at lower temperatures, and will outcompete the nonspecific sequences to which the primers may bind at those lower temperatures. If the primer initially (during the higher temperature phases) binds to the sequence of interest, subsequent rounds of polymerase chain reaction can be performed upon the product to further amplify those fragments. Touchdown increases specificity of the reaction at higher temperatures and increases the efficiency towards the end by lowering the annealing temperature. From a mathematical point of view products of annealing at smaller temperatures are disadvantaged by for the first annealing in cycle and the second one in cycle for .