Тачдаун ПЦР: повышение специфичности и эффективности амплификации.
Touchdown polymerase chain reaction
Тачдаун ПЦР: оптимизация амплификации ДНК, повышение специфичности праймеров. Метод снижает неспецифическое связывание, улучшая результаты ПЦР-анализа.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Цепная полимеразная реакция с постепенным снижением температуры, или ПЦР с постепенным снижением температуры – это метод полимеразной цепной реакции, позволяющий праймерам избегать амплификации неспецифических последовательностей. Температура отжига в ходе полимеразной цепной реакции определяет специфичность связывания праймеров. Температура плавления праймера задает верхний предел температуры отжига. При температурах, лишь немного превышающих эту точку, происходит исключительно специфичное спаривание оснований между праймером и матрицей. При более низких температурах праймеры связываются менее специфично. Неспецифическое связывание праймеров затрудняет интерпретацию результатов полимеразной цепной реакции, поскольку неспецифические последовательности, к которым праймеры присоединяются на ранних стадиях амплификации, из-за экспоненциальной природы амплификации полимеразы, подавляют сигнал от специфических последовательностей.
The touchdown polymerase chain reaction or touchdown style polymerase chain reaction is a method of polymerase chain reaction by which primers avoid amplifying nonspecific sequences. The annealing temperature during a polymerase chain reaction determines the specificity of primer annealing. The melting point of the primer sets the upper limit on annealing temperature. At temperatures just above this point, only very specific base pairing between the primer and the template will occur. At lower temperatures, the primers bind less specifically. Nonspecific primer binding obscures polymerase chain reaction results, as the nonspecific sequences to which primers anneal in early steps of amplification will "swamp out" any specific sequences because of the exponential nature of polymerase amplification.
Метод
Самые ранние этапы цикла полимеразной цепной реакции с постепенным снижением температуры отжига характеризуются высокими температурами отжига. Температура отжига снижается поэтапно с каждым последующим циклом. Праймер отжигает при максимально высокой температуре, которая допускает минимальное неспецифическое связывание, которое он способен переносить. Таким образом, первой амплифицируется последовательность, расположенная между областями наибольшей специфичности праймера; наиболее вероятно, что это и есть интересующая нас последовательность. Эти фрагменты будут дополнительно амплифицированы в последующих раундах при более низких температурах и будут конкурировать с неспецифическими последовательностями, к которым праймеры могут связываться при этих более низких температурах. Если праймер изначально (во время фаз с более высокой температурой) связывается с интересующей последовательностью, последующие раунды полимеразной цепной реакции могут быть проведены на этом продукте для дальнейшей амплификации этих фрагментов. Постепенное снижение температуры отжига повышает специфичность реакции при высоких температурах и увеличивает эффективность в конце за счет снижения температуры отжига. С математической точки зрения, продукты отжига при более низких температурах оказываются в невыгодном положении для первого отжига в цикле и второго отжига в цикле .
The earliest steps of a touchdown polymerase chain reaction cycle have high annealing temperatures. The annealing temperature is decreased in increments for every subsequent set of cycles. The primer will anneal at the highest temperature which is least permissive of nonspecific binding that it is able to tolerate. Thus, the first sequence amplified is the one between the regions of greatest primer specificity; it is most likely that this is the sequence of interest. These fragments will be further amplified during subsequent rounds at lower temperatures, and will outcompete the nonspecific sequences to which the primers may bind at those lower temperatures. If the primer initially (during the higher temperature phases) binds to the sequence of interest, subsequent rounds of polymerase chain reaction can be performed upon the product to further amplify those fragments. Touchdown increases specificity of the reaction at higher temperatures and increases the efficiency towards the end by lowering the annealing temperature. From a mathematical point of view products of annealing at smaller temperatures are disadvantaged by for the first annealing in cycle and the second one in cycle for .