Ақуыз концентрациясын анықтау әдісі

Кіріспе

Ақуыз концентрациясын анықтау әдісі
ғылыми процедура

Бредфорд ақуыздық сынағы (Комасси ақуыздық сынағы деп те аталады) 1976 жылы Марион М. Бредфордпен әзірленген. Бұл ерітіндідегі ақуыз концентрациясын өлшеу үшін қолданылатын спектроскопиялық талдау процедурасы. Реакция өлшенетін ақуыздардың аминқышқылдық құрамына тәуелді.

Принцип

Брэдфорд әдісі – колориметриялық белок анықтамасы, ол Coomassie brilliant blue G 250 бояуының сіңіру қасиеттерінің өзгеруіне негізделген. Coomassie brilliant blue G 250 бояуы үш түрде кездеседі: аниондық (көк), бейтарап (жасыл) және катиондық (қызыл). Қышқыл ортада бояудың қызыл түрі көк түріне айналып, анықталатын белокпен байланысады. Егер белокпен байланысу болмаса, ерітінді қоңыр түсті болып қалады. Бояу ван дер Ваальс күші арқылы белоктың карбоксил тобымен және электростатикалық әрекеттесу арқылы амин тобымен берік, ковалентті емес кешен құрайды. Осы кешеннің қалыптасуы кезінде, Coomassie бояуының қызыл түрі алдымен белоктағы иондалатын топтарға еркін электронын береді, бұл белоктың табиғи күйін бұзады, нәтижесінде оның гидрофобтық қуыстарын ашады. Бұл қуыстар белоктың үшіншілік құрылымында бірінші байланыс арқылы (ван дер Ваальс күштері) бояудың поляр емес аймағымен ковалентті емес байланысқа түседі, бұл оң амин тобын бояудың теріс зарядына жақын орналастырады. Байланыс екінші байланыс арқылы, яғни иондық әрекеттесу арқылы нығайтылады. Бояу белокпен байланысқанда, сіңірудің ұзындығы 465 нм-ден 595 нм-ге өзгереді, сондықтан сіңіру көрсеткіштері 595 нм-де өлшенеді. Катиондық (байланбаған) формасы жасыл/қызыл түсті және сіңіру спектрінің ең жоғары нүктесі 465 нм деп саналады. Гидрофобтық және иондық әрекеттесу арқылы байланысқан бояудың аниондық формасының сіңіру спектрінің ең жоғары нүктесі 595 нм құрайды. 595 нм-дегі сіңірудің артуы байланысқан бояу мөлшеріне, демек, сынамадағы белок мөлшеріне (концентрациясына) пропорционалды. Белок сынамасын дайындау кезінде қолданылған буфер де әсер етуі мүмкін. Буфердің жоғары концентрациясы буфердің конъюгациялық негізінен ерітіндідегі бос протонның азаюына байланысты белок концентрациясын жоғары бағалауға әкелуі мүмкін. Егер белоктың төмен концентрациясы (соответственно, буфер) қолданылса, бұл мәселе туындамайды.

The Bradford assay, a colorimetric protein assay, is based on an absorbance shift of the dye Coomassie brilliant blue G 250. The Coomassie brilliant blue G 250 dye exists in three forms: anionic (blue), neutral (green), and cationic (red). Under acidic conditions, the red form of the dye is converted into its blue form, binding to the protein being assayed. If there's no protein to bind, then the solution will remain brown. The dye forms a strong, noncovalent complex with the protein's carboxyl group by van der Waals force and amino group through electrostatic interactions. During the formation of this complex, the red form of Coomassie dye first donates its free electron to the ionizable groups on the protein, which causes a disruption of the protein's native state, consequently exposing its hydrophobic pockets. These pockets in the protein's tertiary structure bind non covalently to the non polar region of the dye via the first bond interaction (van der Waals forces) which position the positive amine groups in proximity with the negative charge of the dye. The bond is further strengthened by the second bond interaction between the two, the ionic interaction. When the dye binds to the protein, it causes a shift from 465 nm to 595 nm, which is why the absorbance readings are taken at 595 nm. The cationic (unbound) form is green / red and has an absorption spectrum maximum historically held to be at 465 nm. The anionic bound form of the dye which is held together by hydrophobic and ionic interactions, has an absorption spectrum maximum historically held to be at 595 nm. The increase of absorbance at 595 nm is proportional to the amount of bound dye, and thus to the amount (concentration) of protein present in the sample. Other interference may come from the buffer used when preparing the protein sample. A high concentration of buffer will cause an overestimated protein concentration due to depletion of free protons from the solution by conjugate base from the buffer. This will not be a problem if a low concentration of protein (subsequently the buffer) is used.

Артықшылықтар

Көптеген ақуызды ерітінділер спектрофотометрде 280 нм-де ең жоғары сіңіріледі, бұл ультракөк сәуле (UV) диапазоны. Бұл үшін UV диапазонында өлшеуге қабілетті спектрофотометрлер қажет, бірақ көптеген құрылғылар мұндай мүмкіндікке ие емес. Сонымен қатар, 280 нм-дегі сіңірудің максималды деңгейі ақуыздарда тирозин (Y), фенилаланин (F) және/немесе триптофан (W) сияқты ароматикалық аминқышқылдарының болуын талап етеді. Барлық ақуыздарда осы аминқышқылдары кездеспейді, бұл концентрация өлшеуін қателікке ұрындырады. Егер үлгіде нуклеин қышқылдары болса, олар да 280 нм-де жарықты сіңіреді, нәтижелерді одан әрі бұрмалайды. Брэдфорд ақуыздық сынағын қолдану арқылы, ақуыз үлгілерін Coomassie brilliant blue G 250 бояуымен (Брэдфорд реагенті) араластырып, олардың сіңірілуін 595 нм-де өлшеу арқылы осы қиындықтардың бәрінен құтылуға болады. Бұл көрінетін диапазонға жатады және ұялы телефон камерасын пайдалану арқылы дәл өлшеуге мүмкіндік береді. Брэдфорд ақуыздық сынағының процедурасы өте оңай және қарапайым. Ол бір қадамнан тұрады: Брэдфорд реагентін сынамамен бірге сынақ түтігіне қосады. Жақсы араластырғаннан кейін, қоспа бірден көк түске өтеді. Бояу ақуыздармен шамамен 2 минутқа созылатын процесс арқылы байланысқанда, сіңірудің максималды деңгейі қышқылды ерітінділерде 465 нм-ден 595 нм-ге өзгереді. Бұл бояу ақуыздармен электростатикалық өзара әрекеттесулер (амино және карбоксил топтары арқылы), сондай-ақ Ван дер Ваальс өзара әрекеттесулері арқылы күшті ковалентті емес байланыстарды жасайды. Ерітіндідегі ақуыздарға байланысқан молекулалар ғана сіңірудегі осы өзгерісті көрсетеді, бұл бояудың байланыспаған молекулалары тәжірибелік жолмен алынған сіңіру көрсеткішіне әсер ететін болжамды алаңдаушылықты жояды. Бұл әдіс басқа әдістерге қарағанда арзан, қолдануға оңай және бояудың ақуызға жоғары сезімталдығына ие. 5 минут инкубациядан кейін сіңіруді спектрофотометр немесе ұялы телефон камерасы (RGBradford әдісі) арқылы 595 нм-де оқуға болады. Сынаманы дайындау және аяқтау үшін 30 минуттан кем уақыт кетеді. Тәжірибе барлығы бөлме температурасында жүргізіледі. Брэдфорд ақуыздық сынағы 1-ден 20 мкг-ға дейінгі ақуыз мөлшерін өлшеуге мүмкіндік береді. Бұл өте сезімтал техника. Бояу реагенті – фосфор қышқылында дайындалған, пайдалануға дайын тұрақты өнім. Оны 2 аптаға дейін бөлме температурасында сақтауға болады, содан кейін ыдырай бастайды. Ақуыз үлгілерінде әдетте тұздар, еріткіштер, буферлер, консерванттар, тотығуға қарсы заттар және металл келаттаушы заттар болады. Бұл молекулалар көбінесе ақуыздарды еріту және тұрақтандыру үшін қолданылады. Басқа ақуыздық талдаулар, мысалы, BCA және Lowry, тиімсіз болуы мүмкін, өйткені тотығуға қарсы заттар сияқты молекулалар талдауға кедергі келтіреді. Брэдфордты қолдану осы молекулаларға қарсы тиімді болуы мүмкін, өйткені олар бір-бірімен үйлесімді және араласпайды. Сынаудан алынған сызықтық графикті (сіңіру және ақуыз концентрациясы μг/мл) сызықтың еңістігін пайдалану арқылы ақуыз концентрациясын анықтау үшін оңай экстраполяциялауға болады. Бұл өте сезімтал техника. Ол өте қарапайым: 5 минут инкубациядан кейін 595 нм-де OD өлшеу. Бұл әдіс Vis спектрофотометрін немесе ұялы телефон камерасын (RGBradford әдісі) пайдалануға да болады. Кумасси негізіндегі ақуызды анықтау бояғыштарын пайдаланудағы шектеуші фактор – әр түрлі ақуыздарда байқалатын түстің айқын өзгеруі. Бұл шектеуші фактор, әсіресе коллагенге бай ақуыз үлгілерінде, мысалы, панкреатикалық экстракттарда айқын көрінеді, онда Lowry және Брэдфорд әдістері ақуыз құрамын кем бағалайды. Бұл мәселені талдау қоспасына циклодекстриндерді қосу арқылы жеңілдетуге болады. Сызықтық емес нәтижелердің көп бөлігі ақуыз қосылған кезде бұзылатын бояудың екі түрлі түрі арасындағы тепе-теңдіктен туындайды. Брэдфорд сынағы сіңірулердің қатынасын өлшеу арқылы (595 нм / 450 нм) сызықтыққа ие болады. Бұл модификацияланған Брэдфорд әдісі дәстүрлі әдіске қарағанда шамамен 10 есе сезімтал. Брэдфордтың бастапқы әдісінде ақуыздарға байланысу үшін қолданылатын Coomassie Blue G250 бояуы ақуыздардың аргинин және лизин топтарына тез байланысады. Бұл кемшілік, өйткені бояудың осы аминқышқылдарына байланысуға бейімделуі әр түрлі ақуыздарда сынақтың әртүрлі реакциясына әкелуі мүмкін. Бұл ауытқуды түзету үшін бастапқы әдіске өзгерістер енгізілді, мысалы, NaOH қосу арқылы pH-ты арттыру немесе бояғыш мөлшерін арттыру. Бұл өзгерістер сезімталдықты азайтуы мүмкін болса да, модификацияланған әдіс сынамамен кедергі жасайтын жуғыш заттарға сезімтал болады.

Many protein containing solutions have the highest absorption at 280 nm in the spectrophotometer, the UV range. This requires spectrophotometers capable of measuring in the UV range, which many cannot. Additionally, the absorption maxima at 280 nm requires that proteins contain aromatic amino acids such as tyrosine (Y), phenylalanine (F) and/or tryptophan (W). Not all proteins contain these amino acids, a fact which will skew the concentration measurements. If nucleic acids are present in the sample, they would also absorb light at 280 nm, skewing the results further. By using the Bradford protein assay, one can avoid all of these complications by simply mixing the protein samples with the Coomassie brilliant blue G 250 dye (Bradford reagent) and measuring their absorbances at 595 nm, which is in the visible range and may be accurately measured by the use of a mobile smartphone camera. The procedure for Bradford protein assay is very easy and simple to follow. It is done in one step where the Bradford reagent is added to a test tube along with the sample. After mixing well, the mixture almost immediately changes to a blue color. When the dye binds to the proteins through a process that takes about 2 minutes, a change in the absorption maximum of the dye from 465 nm to 595 nm in acidic solutions occurs. This dye creates strong noncovalent bonds with the proteins, via electrostatic interactions with the amino and carboxyl groups, as well as Van Der Waals interactions. Only the molecules that bind to the proteins in solution exhibit this change in absorption, which eliminates the concern that unbound molecules of the dye might contribute to the experimentally obtained absorption reading. This process is more beneficial since it is less pricey than other methods, easy to use, and has high sensitivity of the dye for protein. After 5 minutes of incubation, the absorbance can be read at 595 nm using a spectrophotometer or a mobile smartphone camera (RGBradford method). The total time it takes to set up and complete the assay is under 30 minutes. The entire experiment is done at room temperature. The Bradford protein assay can measure protein quantities as little as 1 to 20 μg. It is an extremely sensitive technique. The dye reagent is a stable ready to use product prepared in phosphoric acid. It can remain at room temperature for up to 2 weeks before it starts to degrade. Protein samples usually contain salts, solvents, buffers, preservatives, reducing agents and metal chelating agents. These molecules are frequently used for solubilizing and stabilizing proteins. Other protein assay like BCA and Lowry are ineffective because molecules like reducing agents interfere with the assay. Using Bradford can be advantageous against these molecules because they are compatible to each other and will not interfere. The linear graph acquired from the assay (absorbance versus protein concentration in μg/mL) can be easily extrapolated to determine the concentration of proteins by using the slope of the line. It is a sensitive technique. It is also very simple: measuring the OD at 595 nm after 5 minutes of incubation. This method can also make use of a Vis spectrophotometer or a mobile smartphone camera (RGBradford method). A limiting factor in using Coomassie based protein determination dyes stems from the significant variation in color yield observed across different proteins This limiting factor is notably evident in collagen rich protein samples, like pancreatic extracts, where both the Lowry and Bradford methods tend to underestimate protein content. It is also inhibited by the presence of detergents, although this problem can be alleviated by the addition of cyclodextrins to the assay mixture. Much of the non linearity stems from the equilibrium between two different forms of the dye which is perturbed by adding the protein. The Bradford assay linearizes by measuring the ratio of the absorbances, 595 over 450 nm. This modified Bradford assay is approximately 10 times more sensitive than the conventional one. The Coomassie Blue G250 dye used to bind to the proteins in the original Bradford method readily binds to arginine and lysine groups of proteins. This is a disadvantage because the preference of the dye to bind to these amino acids can result in a varied response of the assay between different proteins. Changes to the original method, such as increasing the pH by adding NaOH or adding more dye have been made to correct this variation. Although these modifications result in a less sensitive assay, a modified method becomes sensitive to detergents that can interfere with sample.

Брэдфорд ақуызын анықтаудың болашағы

Жақсыланған Брэдфорд ақуыздық сынағы үшін жаңа модификациялар жүргізілуде, олар коллаген ақуыздарын анықтаудың дәлдігін арттыруға бағытталған. Бір маңызды өзгеріс – шамамен 0,0035% натрий додецил сульфаты (SDS) қосу. Бұл SDS қосылуы I, III және IV типтегі үш негізгі коллаген ақуызы үшін түстік реакцияны төрт есеге арттырады, сонымен бірге коллаген емес ақуыздардың сіңірілуін азайтады. Протеин концентрациясының кең диапазонын пайдалану белгісіз протеиннің концентрациясын анықтауды қиындатады. Осы стандартты қисық белгісіз протеиннің концентрациясын анықтау үшін қолданылады. Келесі бөлім стандартты қисықтан белгісіз протеиннің концентрациясына қалай өту керектігін түсіндіреді. Біріншіден, ең жақсы сыйымдылық сызығын немесе сызықтық регрессияны қосып, теңдеуді графикте көрсетіңіз. Идеалды жағдайда, R² мәні 1-ге мүмкіндігінше жақын болуы керек. R – бұл әрбір дерек нүктесінен сыйымдылықтың квадраттық айырмасының қосындысы. Сондықтан, егер R² бірден әлдеқайда төмен болса, сенімді деректер алу үшін тәжірибені қайта жасауды қарастырыңыз. Графиктелген теңдеу белгісіз үлгілердің сіңірілуін және осыған сәйкес концентрациясын есептеуге мүмкіндік береді. 1-суретте x – концентрация, y – сіңірілу, сондықтан теңдеуді x-ті табу үшін қайта құру қажет және өлшенген белгісіздің сіңірілу мәнін енгізу қажет. Белгісіздің сіңірілу мәні стандартты қисықтың шегінен тыс болуы мүмкін. Мұндай мәндерді есептеуге болмайды, өйткені берілген теңдеу өз шектерінен тыс мәндерге қолданылмайды. Ірі масштабта, Beer-Lambert заңы A=εLC арқылы жойылу коэффициентін есептеу қажет, мұнда A – өлшенген сіңірілу, ε – стандартты қисықтың еңісі, L – куветтің ұзындығы және C – анықталатын концентрация. Шағын масштабта кувет қолданылмауы мүмкін, сондықтан x-ті табу үшін теңдеуді ғана қайта құру жеткілікті. Деректерге сәйкес келетін концентрацияға жету үшін белгісіз үлгілердің сұйылтулары, концентрациялары және бірліктері нормаланған болуы керек (1-кесте). Мұны істеу үшін, концентрацияны нормалау үшін концентрацияны протеин көлеміне бөлу керек және протеинге жасалған кез келген сұйылтуды түзету үшін сұйылтылған көлемге көбейту керек.

New modifications for an improved Bradford Protein Assay have been underway that specifically focuses on enhancing detection accuracy for collagen proteins. One notable modification involves incorporating small amounts, approximately .0035%, of sodium dodecyl sulfate (SDS). This inclusion of SDS has been shown to result in a fourfold increase in color response for three key collagen proteins—Collagen types I, III, and IV—while simultaneously decreasing the absorbance of non collagen proteins. Using a broad range of protein concentration will make it harder to determine the concentration of the unknown protein. This standard curve is then used to determine the concentration of the unknown protein. The following elaborates on how one goes from the standard curve to the concentration of the unknown. First, add a line of best fit, or Linear regression and display the equation on the chart. Ideally, the R2 value will be as close to 1 as possible. R represents the sum of the square values of the fit subtracted from each data point. Therefore, if R2 is much less than one, consider redoing the experiment to get one with more reliable data. The equation displayed on the chart gives a means for calculating the absorbance and therefore concentration of the unknown samples. In Graph 1, x is concentration and y is absorbance, so one must rearrange the equation to solve for x and enter the absorbance of the measured unknown. It is likely that the unknown will have absorbance numbers outside the range of the standard. These should not be included calculations, as the equation given cannot apply to numbers outside of its limitations. In a large scale, one must compute the extinction coefficient using the Beer Lambert Law A=εLC in which A is the measured absorbance, ε is the slope of the standard curve, L is the length of the cuvette, and C is the concentration being determined. In a micro scale, a cuvette may not be used and therefore one only has to rearrange to solve for x. In order to attain a concentration that makes sense with the data, the dilutions, concentrations, and units of the unknown must be normalized (Table 1). To do this, one must divide concentration by volume of protein in order to normalize concentration and multiply by amount diluted to correct for any dilution made in the protein before performing the assay.