Метод определения концентрации белка Брэдфорда

Введение

Метод определения концентрации белка
научная процедура

Метод Брэдфордского белкового анализа (также известный как метод Кумасси) был разработан Марион М. Брэдфорд в 1976 году. Это спектроскопическая аналитическая процедура, используемая для измерения концентрации белка в растворе. Реакция зависит от аминокислотного состава определяемых белков.

Принцип

Анализ Брэдфорда, колориметрический метод определения содержания белка, основан на сдвиге абсорбции красителя Coomassie brilliant blue G 250. Краситель Coomassie brilliant blue G 250 существует в трех формах: анионной (синей), нейтральной (зеленой) и катионной (красной). В кислых условиях красная форма красителя превращается в синюю, связываясь с определяемым белком. Если белок отсутствует, раствор останется коричневым. Краситель образует прочный, нековалентный комплекс с карбоксильными группами белка посредством сил Ван-дер-Ваальса и с аминогруппами посредством электростатических взаимодействий. В процессе образования этого комплекса красная форма красителя Кумасси сначала отдает свой свободный электрон ионизируемым группам белка, что приводит к нарушению нативной структуры белка и, как следствие, к обнажению его гидрофобных карманов. Эти карманы в третичной структуре белка нековалентно связываются с неполярной областью красителя посредством первого типа взаимодействия – сил Ван-дер-Ваальса, которые располагают положительно заряженные аминогруппы вблизи отрицательного заряда красителя. Связь дополнительно усиливается вторым типом взаимодействия – ионным взаимодействием. При связывании красителя с белком происходит сдвиг абсорбции с 465 нм до 595 нм, поэтому измерения абсорбции проводятся при 595 нм. Катионная (несвязанная) форма красителя имеет зеленый/красный цвет и исторически характеризуется максимальным спектром поглощения при 465 нм. Анионная связанная форма красителя, удерживаемая вместе гидрофобными и ионными взаимодействиями, исторически характеризуется максимальным спектром поглощения при 595 нм. Увеличение абсорбции при 595 нм пропорционально количеству связанного красителя, а следовательно, количеству (концентрации) белка в образце. Другими источниками помех может быть буфер, используемый при приготовлении белкового образца. Высокая концентрация буфера может привести к завышенной оценке концентрации белка из-за истощения свободных протонов в растворе конъюгированным основанием буфера. Это не будет проблемой, если используется низкая концентрация белка (и, следовательно, буфера).

The Bradford assay, a colorimetric protein assay, is based on an absorbance shift of the dye Coomassie brilliant blue G 250. The Coomassie brilliant blue G 250 dye exists in three forms: anionic (blue), neutral (green), and cationic (red). Under acidic conditions, the red form of the dye is converted into its blue form, binding to the protein being assayed. If there's no protein to bind, then the solution will remain brown. The dye forms a strong, noncovalent complex with the protein's carboxyl group by van der Waals force and amino group through electrostatic interactions. During the formation of this complex, the red form of Coomassie dye first donates its free electron to the ionizable groups on the protein, which causes a disruption of the protein's native state, consequently exposing its hydrophobic pockets. These pockets in the protein's tertiary structure bind non covalently to the non polar region of the dye via the first bond interaction (van der Waals forces) which position the positive amine groups in proximity with the negative charge of the dye. The bond is further strengthened by the second bond interaction between the two, the ionic interaction. When the dye binds to the protein, it causes a shift from 465 nm to 595 nm, which is why the absorbance readings are taken at 595 nm. The cationic (unbound) form is green / red and has an absorption spectrum maximum historically held to be at 465 nm. The anionic bound form of the dye which is held together by hydrophobic and ionic interactions, has an absorption spectrum maximum historically held to be at 595 nm. The increase of absorbance at 595 nm is proportional to the amount of bound dye, and thus to the amount (concentration) of protein present in the sample. Other interference may come from the buffer used when preparing the protein sample. A high concentration of buffer will cause an overestimated protein concentration due to depletion of free protons from the solution by conjugate base from the buffer. This will not be a problem if a low concentration of protein (subsequently the buffer) is used.

Преимущества

Многие растворы, содержащие белки, имеют наибольшее поглощение при 280 нм в спектрофотометре, в УФ-диапазоне. Для этого требуются спектрофотометры, способные измерять в УФ-диапазоне, что многие не могут. Кроме того, для достижения максимального поглощения при 280 нм необходимо, чтобы белки содержали ароматические аминокислоты, такие как тирозин (Y), фенилаланин (F) и/или триптофан (W). Не все белки содержат эти аминокислоты, что может исказить измерения концентрации. Если в образце присутствуют нуклеиновые кислоты, они также поглощают свет при 280 нм, что еще больше искажает результаты. Используя белковый анализ Брэдфорда, можно избежать всех этих осложнений, просто смешивая образцы белка с красителем Coomassie brilliant blue G 250 (реагентом Брэдфорда) и измеряя их поглощение при 595 нм, что находится в видимом диапазоне и может быть точно измерено с помощью мобильной камеры смартфона. Процедура белкового анализа Брэдфорда очень проста и удобна в использовании. Она выполняется в один этап, когда реагент Брэдфорда добавляется в пробирку вместе с образцом. После тщательного перемешивания смесь почти сразу же приобретает синий цвет. Когда краситель связывается с белками в процессе, занимающем около 2 минут, происходит изменение максимума поглощения красителя с 465 нм до 595 нм в кислых растворах. Этот краситель образует прочные нековалентные связи с белками посредством электростатических взаимодействий с амино- и карбоксильными группами, а также взаимодействий Ван-дер-Ваальса. Только молекулы, связанные с белками в растворе, демонстрируют это изменение поглощения, что исключает опасения, что несвязанные молекулы красителя могут повлиять на экспериментально полученное значение поглощения. Этот метод более выгоден, поскольку он менее затратен, чем другие методы, прост в использовании и обладает высокой чувствительностью красителя к белку. После 5 минут инкубации поглощение можно измерить при 595 нм с помощью спектрофотометра или камеры мобильного смартфона (метод RGBradford). Общее время, необходимое для подготовки и завершения анализа, составляет менее 30 минут. Весь эксперимент проводится при комнатной температуре. Белковый анализ Брэдфорда может измерять количество белка от 1 до 20 мкг. Это чрезвычайно чувствительная методика. Краситель-реагент представляет собой стабильный продукт, готовый к использованию, приготовленный в фосфорной кислоте. Он может храниться при комнатной температуре до 2 недель, прежде чем начнет разлагаться. Образцы белка обычно содержат соли, растворители, буферы, консерванты, восстановители и хелатирующие агенты металлов. Эти молекулы часто используются для солюбилизации и стабилизации белков. Другие методы определения белка, такие как BCA и Lowry, неэффективны, поскольку молекулы, такие как восстановители, мешают анализу. Использование метода Брэдфорда может быть предпочтительнее, поскольку эти молекулы совместимы друг с другом и не будут мешать. Линейный график, полученный в результате анализа (поглощение в зависимости от концентрации белка в мкг/мл), можно легко экстраполировать для определения концентрации белков, используя наклон линии. Это чувствительная методика. Она также очень проста: измерение оптической плотности при 595 нм после 5 минут инкубации. Этот метод также может использовать Vis-спектрофотометр или камеру мобильного смартфона (метод RGBradford). Ограничивающим фактором при использовании красителей на основе Coomassie для определения белка является значительная вариация цветового выхода, наблюдаемая для разных белков. Этот ограничивающий фактор особенно заметен в образцах белка, богатых коллагеном, таких как экстракты поджелудочной железы, где как методы Лоури, так и Брэдфорд имеют тенденцию недооценивать содержание белка. Наличие детергентов также ингибирует этот метод, хотя эту проблему можно смягчить путем добавления циклодекстринов в аналитическую смесь. Большая часть нелинейности обусловлена равновесием между двумя различными формами красителя, которое нарушается при добавлении белка. Анализ Брэдфорда линеаризуется путем измерения отношения поглощений при 595 нм и 450 нм. Этот модифицированный анализ Брэдфорда примерно в 10 раз более чувствителен, чем традиционный. Краситель Coomassie Blue G250, используемый для связывания с белками в оригинальном методе Брэдфорда, легко связывается с аргининовыми и лизиновыми группами белков. Это недостаток, поскольку предпочтение красителя к связыванию с этими аминокислотами может привести к различной реакции анализа для разных белков. В оригинальный метод были внесены изменения, такие как повышение pH путем добавления NaOH или увеличение количества красителя, чтобы скорректировать эту вариацию. Хотя эти модификации приводят к менее чувствительному анализу, модифицированный метод становится чувствительным к детергентам, которые могут мешать анализу.

Many protein containing solutions have the highest absorption at 280 nm in the spectrophotometer, the UV range. This requires spectrophotometers capable of measuring in the UV range, which many cannot. Additionally, the absorption maxima at 280 nm requires that proteins contain aromatic amino acids such as tyrosine (Y), phenylalanine (F) and/or tryptophan (W). Not all proteins contain these amino acids, a fact which will skew the concentration measurements. If nucleic acids are present in the sample, they would also absorb light at 280 nm, skewing the results further. By using the Bradford protein assay, one can avoid all of these complications by simply mixing the protein samples with the Coomassie brilliant blue G 250 dye (Bradford reagent) and measuring their absorbances at 595 nm, which is in the visible range and may be accurately measured by the use of a mobile smartphone camera. The procedure for Bradford protein assay is very easy and simple to follow. It is done in one step where the Bradford reagent is added to a test tube along with the sample. After mixing well, the mixture almost immediately changes to a blue color. When the dye binds to the proteins through a process that takes about 2 minutes, a change in the absorption maximum of the dye from 465 nm to 595 nm in acidic solutions occurs. This dye creates strong noncovalent bonds with the proteins, via electrostatic interactions with the amino and carboxyl groups, as well as Van Der Waals interactions. Only the molecules that bind to the proteins in solution exhibit this change in absorption, which eliminates the concern that unbound molecules of the dye might contribute to the experimentally obtained absorption reading. This process is more beneficial since it is less pricey than other methods, easy to use, and has high sensitivity of the dye for protein. After 5 minutes of incubation, the absorbance can be read at 595 nm using a spectrophotometer or a mobile smartphone camera (RGBradford method). The total time it takes to set up and complete the assay is under 30 minutes. The entire experiment is done at room temperature. The Bradford protein assay can measure protein quantities as little as 1 to 20 μg. It is an extremely sensitive technique. The dye reagent is a stable ready to use product prepared in phosphoric acid. It can remain at room temperature for up to 2 weeks before it starts to degrade. Protein samples usually contain salts, solvents, buffers, preservatives, reducing agents and metal chelating agents. These molecules are frequently used for solubilizing and stabilizing proteins. Other protein assay like BCA and Lowry are ineffective because molecules like reducing agents interfere with the assay. Using Bradford can be advantageous against these molecules because they are compatible to each other and will not interfere. The linear graph acquired from the assay (absorbance versus protein concentration in μg/mL) can be easily extrapolated to determine the concentration of proteins by using the slope of the line. It is a sensitive technique. It is also very simple: measuring the OD at 595 nm after 5 minutes of incubation. This method can also make use of a Vis spectrophotometer or a mobile smartphone camera (RGBradford method). A limiting factor in using Coomassie based protein determination dyes stems from the significant variation in color yield observed across different proteins This limiting factor is notably evident in collagen rich protein samples, like pancreatic extracts, where both the Lowry and Bradford methods tend to underestimate protein content. It is also inhibited by the presence of detergents, although this problem can be alleviated by the addition of cyclodextrins to the assay mixture. Much of the non linearity stems from the equilibrium between two different forms of the dye which is perturbed by adding the protein. The Bradford assay linearizes by measuring the ratio of the absorbances, 595 over 450 nm. This modified Bradford assay is approximately 10 times more sensitive than the conventional one. The Coomassie Blue G250 dye used to bind to the proteins in the original Bradford method readily binds to arginine and lysine groups of proteins. This is a disadvantage because the preference of the dye to bind to these amino acids can result in a varied response of the assay between different proteins. Changes to the original method, such as increasing the pH by adding NaOH or adding more dye have been made to correct this variation. Although these modifications result in a less sensitive assay, a modified method becomes sensitive to detergents that can interfere with sample.

Будущее Брэдфордского белкового анализа

В настоящее время проводятся новые модификации улучшенного белкового анализа Брэдфорда, направленные на повышение точности определения белков коллагена. Одной из заметных модификаций является добавление небольшого количества, примерно 0,0035%, додецилсульфата натрия (SDS). Показано, что это добавление SDS приводит к четырехкратному увеличению цветовой реакции для трех ключевых белков коллагена – коллагена I, III и IV типов, одновременно снижая поглощение белков, не являющихся коллагеном. Использование широкого диапазона концентраций белка затруднит определение концентрации неизвестного белка. Эта стандартная кривая затем используется для определения концентрации неизвестного белка. Далее подробно описано, как перейти от стандартной кривой к концентрации неизвестного. Сначала добавьте линию наилучшего соответствия, или линейную регрессию, и отобразите уравнение на графике. В идеале значение R² должно быть максимально близким к 1. R представляет собой сумму квадратов отклонений от каждой точки данных. Следовательно, если R² значительно меньше единицы, рассмотрите возможность повторения эксперимента для получения более достоверных данных. Уравнение, отображаемое на графике, позволяет рассчитать поглощение и, следовательно, концентрацию неизвестных образцов. На графике 1 x – концентрация, а y – поглощение, поэтому необходимо преобразовать уравнение для решения относительно x и ввести поглощение измеренного неизвестного образца. Вероятно, что поглощение неизвестного образца будет выходить за пределы диапазона стандарта. Эти значения не следует включать в расчеты, поскольку данное уравнение неприменимо к значениям, выходящим за его пределы. В макромасштабе необходимо вычислить коэффициент экстинкции, используя закон Бера-Ламберта A=εLC, где A – измеренное поглощение, ε – наклон стандартной кривой, L – длина кюветы, а C – определяемая концентрация. В микромасштабе кювета может не использоваться, поэтому достаточно преобразовать уравнение для решения относительно x. Для получения концентрации, соответствующей данным, необходимо нормализовать разведения, концентрации и единицы измерения неизвестного образца (таблица 1). Для этого необходимо разделить концентрацию на объем белка для нормализации концентрации и умножить на степень разбавления для учета любого разбавления, внесенного в белок перед проведением анализа.

New modifications for an improved Bradford Protein Assay have been underway that specifically focuses on enhancing detection accuracy for collagen proteins. One notable modification involves incorporating small amounts, approximately .0035%, of sodium dodecyl sulfate (SDS). This inclusion of SDS has been shown to result in a fourfold increase in color response for three key collagen proteins—Collagen types I, III, and IV—while simultaneously decreasing the absorbance of non collagen proteins. Using a broad range of protein concentration will make it harder to determine the concentration of the unknown protein. This standard curve is then used to determine the concentration of the unknown protein. The following elaborates on how one goes from the standard curve to the concentration of the unknown. First, add a line of best fit, or Linear regression and display the equation on the chart. Ideally, the R2 value will be as close to 1 as possible. R represents the sum of the square values of the fit subtracted from each data point. Therefore, if R2 is much less than one, consider redoing the experiment to get one with more reliable data. The equation displayed on the chart gives a means for calculating the absorbance and therefore concentration of the unknown samples. In Graph 1, x is concentration and y is absorbance, so one must rearrange the equation to solve for x and enter the absorbance of the measured unknown. It is likely that the unknown will have absorbance numbers outside the range of the standard. These should not be included calculations, as the equation given cannot apply to numbers outside of its limitations. In a large scale, one must compute the extinction coefficient using the Beer Lambert Law A=εLC in which A is the measured absorbance, ε is the slope of the standard curve, L is the length of the cuvette, and C is the concentration being determined. In a micro scale, a cuvette may not be used and therefore one only has to rearrange to solve for x. In order to attain a concentration that makes sense with the data, the dilutions, concentrations, and units of the unknown must be normalized (Table 1). To do this, one must divide concentration by volume of protein in order to normalize concentration and multiply by amount diluted to correct for any dilution made in the protein before performing the assay.