Гендік модификация: гендік жою әдісі – организм геномынан белгілі бір генді алып тастау немесе істен шығару. Зерттеулерде ген функциясын анықтауға көмектеседі.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Генетикалық техника
Genetic technique
Гендік нокаут (генді өшіру немесе генді белсенділігінен айыру деп те аталады) – кеңінен қолданылатын генетикалық инженерия техникасы, ол организмнің геноміндегі белгілі бір генді мақсатты түрде жоюды немесе белсенділігінен айыруды қамтиды. Бұл гомологтық рекомбинация, CRISPR Cas9 және TALENs сияқты әр түрлі әдістер арқылы жүзеге асырылуы мүмкін. Гендік нокауттың басты артықшылығы – зерттеушілерге белгілі бір геннің қызметін тірі организмде (in vivo) зерттеуге және геннің қалыпты даму мен физиологиядағы, сондай-ақ аурулардың патологиясындағы рөлін түсінуге мүмкіндік беруі. Нокаутталған гені бар организмнің фенотипін зерттеу арқылы зерттеушілер ген қатысатын биологиялық процестер туралы түсінік ала алады. Гендік нокауттың екі негізгі түрі бар: толық және шартты. Толық гендік нокаут генді тұрақты түрде белсенділіктен айырады, ал шартты гендік нокаут генді белгілі бір уақытта немесе белгілі бір тіндерде қосуға және өшіруге мүмкіндік береді. Шартты нокауттар даму процестерін зерттеуде және белгілі бір жасуша түрлеріндегі немесе тіндердегі геннің рөлін түсінуде ерекше пайдалы. Гендік нокауттар бактериялар, ашытқылар, жеміс ұшқыштары, зебра балықтары және тышқандар сияқты көптеген түрлі организмдерде кеңінен қолданылған. Тышқандарда гендік нокауттар даму, физиология және қатерлі ісіктерді зерттеуде белгілі бір гендердің қызметін зерттеу үшін жиі қолданылады. Тышқан моделінде гендік нокауттарды қолдану адам ауруларын зерттеуде аса құнды болды. Мысалы, тышқандағы гендік нокауттар қатерлі ісік, неврологиялық аурулар, иммундық бұзылыстар және метаболизмдік бұзылыстардағы белгілі бір гендердің рөлін зерттеу үшін пайдаланылды. Дегенмен, гендік нокауттың да шектеулері бар. Мысалы, бір геннің жоғалуы генетикалық бұзылыстың әсерін толыққанды еліктемеуі мүмкін, ал нокауттың басқа гендерге немесе жолдарға күтпеген әсері болуы мүмкін. Сонымен қатар, гендік нокаут әрқашан адам ауруының жақсы моделі бола бермейді, өйткені тышқанның геномы адам геномынан өзгеше, ал тышқанның физиологиясы адам физиологиясынан ерекшеленеді. КО техникасы – генді енгізудің кері процесі. Организмде екі генді бір мезгілде нокауттау екі еселік нокаут (DKO) деп аталады. Сол сияқты үш еселік нокаут (TKO) және төрт еселік нокаут (QKO) терминдері тиісінше үш немесе төрт нокаутталған гендерді сипаттау үшін қолданылады. Алайда, гетерозиготалық және гомозиготалық КО арасында ажырату қажет. Бірінші жағдайда геннің екі көшірмесінің (аллельдердің) біреуі ғана нокаутталады, ал екінші жағдайда екеуі де нокаутталады.
Gene knockouts (also known as gene deletion or gene inactivation) are a widely used genetic engineering technique that involves the targeted removal or inactivation of a specific gene within an organism's genome. This can be done through a variety of methods, including homologous recombination, CRISPR Cas9, and TALENs. One of the main advantages of gene knockouts is that they allow researchers to study the function of a specific gene in vivo, and to understand the role of the gene in normal development and physiology as well as in the pathology of diseases. By studying the phenotype of the organism with the knocked out gene, researchers can gain insights into the biological processes that the gene is involved in. There are two main types of gene knockouts: complete and conditional. A complete gene knockout permanently inactivates the gene, while a conditional gene knockout allows for the gene to be turned off and on at specific times or in specific tissues. Conditional knockouts are particularly useful for studying developmental processes and for understanding the role of a gene in specific cell types or tissues. Gene knockouts have been widely used in many different organisms, including bacteria, yeast, fruit flies, zebrafish, and mice. In mice, gene knockouts are commonly used to study the function of specific genes in development, physiology, and cancer research. The use of gene knockouts in mouse models has been particularly valuable in the study of human diseases. For example, gene knockouts in mice have been used to study the role of specific genes in cancer, neurological disorders, immune disorders, and metabolic disorders. However, gene knockouts also have some limitations. For example, the loss of a single gene may not fully mimic the effects of a genetic disorder, and the knockouts may have unintended effects on other genes or pathways. Additionally, gene knockouts are not always a good model for human disease as the mouse genome is not identical to the human genome, and mouse physiology is different from human physiology. The KO technique is essentially the opposite of a gene knock in. Knocking out two genes simultaneously in an organism is known as a double knockout (DKO). Similarly the terms triple knockout (TKO) and quadruple knockouts (QKO) are used to describe three or four knocked out genes, respectively. However, one needs to distinguish between heterozygous and homozygous KOs. In the former, only one of two gene copies (alleles) is knocked out, in the latter both are knocked out.
Әдістер
Нокауттар түрлі техникалар арқылы жүзеге асырылады. Алғашқыда, табиғи мутациялар анықталып, одан кейін геннің жоғалуы немесе инактивациясы ДНК секвенирлеу немесе басқа әдістермен расталатын болды.
Knockouts are accomplished through a variety of techniques. Originally, naturally occurring mutations were identified and then gene loss or inactivation had to be established by DNA sequencing or other methods.
Мутация арқылы гендік нокаут
Гендік нокаут мутация арқылы бактерияларда кеңінен қолданылады. Осы техниканы Escherichia coli бактериясында қолданудың алғашқы мысалы 1989 жылы Hamilton және авторлар тобы жариялаған. Бұл тәжірибеде генді жою үшін екі тізбекті рекомбинация пайдаланылды. Бұл жұмыс бактериялардағы функционалды генді алып тастау немесе ауыстырудың мүмкіндігін көрсетті. Кейіннен бұл әдіс басқа организмдер үшін, әсіресе тышқандар сияқты зерттеу жануарлары үшін жетілдірілді. Гендік нокаут жасалған тышқандар адамдардағы аналогтары бар гендерді зерттеу үшін жиі қолданылады, бұл гендер ауруларға қатысты болуы мүмкін. Нокаут тышқандарды пайдалана отырып жүргізілген зерттеудің мысалы – қытайлық хан ұлтының кенеттен түсіндірілмейтін түнгі өлім синдромы (SUNDS) және Бругада синдромындағы Xirp ақуыздарының атқаратын рөлін зерттеу.
Gene knockout by mutation is commonly carried out in bacteria. An early instance of the use of this technique in Escherichia coli was published in 1989 by Hamilton, et al. In this experiment, two sequential recombinations were used to delete the gene. This work established the feasibility of removing or replacing a functional gene in bacteria. That method has since been developed for other organisms, particularly research animals, like mice. Knockout mice are commonly used to study genes with human equivalents that may have significance for disease. An example of a study using knockout mice is an investigation of the roles of Xirp proteins in Sudden Unexplained Nocturnal Death Syndrome (SUNDS) and Brugada Syndrome in the Chinese Han Population.
Генді үндету
Гендік нокаут зерттеулері үшін РНК-ның араласуы (RNAi), генді үнсіздендіру деп те аталатын, жақында пайда болған әдіс, кеңінен қолданыла бастады. РНК-ның араласуы (RNAi) кезінде, белгілі бір геннің хабаршы РНК-сы кішкентай араласатын РНК (siRNA) немесе қысқа түйіншелі РНК (shRNA) арқылы белсенділігінен айырылады. Бұл геннің өршуін тоқтатып, оның қызметін жояды. Bcl 2 және p53 сияқты онкогендер, сондай-ақ неврологиялық ауруларға, генетикалық бұзылыстарға және вирустық инфекцияларға байланысты гендер РНК-ның араласуы (RNAi) арқылы генді үнсіздендіру үшін нысана ретінде таңдалған.
For gene knockout investigations, RNA interference (RNAi), a more recent method, also known as gene silencing, has gained popularity. In RNA interference (RNAi), messenger RNA for a particular gene is inactivated using small interfering RNA (siRNA) or short hairpin RNA (shRNA). This effectively stops the gene from being expressed. Oncogenes like Bcl 2 and p53, as well as genes linked to neurological disease, genetic disorders, and viral infections, have all been targeted for gene silencing utilizing RNA interference (RNAi).
Гомологты рекомбинация
Гомологты рекомбинация – бір-біріне ұқсас негіздер тізбектерінің кең аймақтарын қамтитын екі ДНК талшығы арасындағы гендерді алмасу. Эукариоттық түрлерде, бактерияларда және кейбір вирустарда гомологты рекомбинация спонтанды түрде жүреді және генетикалық инженерияда пайдалы құрал болып табылады. Эукариоттарда мейоз кезінде жүзеге асатын гомологты рекомбинация, қос тізбекті ДНК үзілістерін жөндеу үшін маңызды және хромосомалық кроссинг кезінде генетикалық ақпараттың қозғалысына мүмкіндік беріп, генетикалық вариацияны ынталандырады. Бактериялардағы ДНК жөндеудің маңызды механизмі болып табылатын гомологты рекомбинация, гендерді көлденең тасымалдау және трансформация арқылы алынған генетикалық материалды ДНК-ға енгізуге мүмкіндік береді. Вирустардағы гомологты рекомбинация вирус эволюциясының барысына әсер етеді. Гендік инженерияда қолданылатын генді нысанаға алу түрі – гомологты рекомбинация, белгілі бір геннің функциясын жақсырақ түсіну үшін оған жасалған мутацияны енгізуді қамтиды. Бұл әдіс, нысаналы генге ұқсас тізбегі бар, ал нысаналы геннің жоғары және төмен жағындағы тізбектермен шектеліп, жасушаға шетелдік ДНК енгізуді қамтиды. Нысаналы геннің ДНК-сы, жасуша ұқсас шектес аймақтарды гомологтар ретінде танитын кезде, репликация кезінде шетелдік ДНК-мен алмастырылады. Алмасу арқылы нысаналы ген "нокаутталады". Осы әдісті қолдану арқылы егешқұйрықтардың эмбрионалды дің жасушаларындағы белгілі бір аллельдерді нысанаға алып, нокаут егешқұйрықтар жасауға болады. Гендік нысанаға алудың көмегімен көптеген егешқұйрық гендері өшірілді, нәтижесінде қатерлі ісік, қант диабеті, жүрек-қан тамырлары аурулары және неврологиялық бұзылыстар сияқты әртүрлі адам ауруларының жүздерше түрлі егешқұйрық модельдері құрылды. Марио Капекки, сэр Мартин Дж. Эванс және Оливер Смитхис егешқұйрық жасушаларында гомологты рекомбинация бойынша маңызды зерттеулер жүргізді және олардың табыстары үшін 2007 жылғы Физиология және Медицина саласындағы Нобель сыйлығын бөлісті. Дәстүрлі түрде гомологты рекомбинация генді нокауттаудың негізгі әдісі болды. Бұл әдіс, қажетті мутацияны қамтитын ДНК конструкциясын жасауды қамтиды. Нокаут мақсаты үшін бұл әдетте қажетті нокаут генінің орнына дәріге төзімділік маркерін қамтиды. Конструкция сонымен қатар нысаналы тізбекке кем дегенде 2 кб гомологияны қамтиды. Конструкцияны дің жасушаларына микроинъекция немесе электропорация арқылы жеткізуге болады. Бұл әдіс, ДНК конструкциясын бар ДНК-ға қайта біріктіру үшін жасушаның өзінің жөндеу механизмдеріне сенеді. Бұл геннің тізбегінің өзгеруіне әкеледі, және көп жағдайда ген, егер ол трансляцияланса, функционалды емес белокқа трансляцияланады. Дегенмен, бұл тиімді емес процесс, өйткені гомологты рекомбинация ДНК интеграцияларының тек 10−2 - 10−3 бөлігін құрайды. Бұл бұрыс жасалуы мүмкін, сондықтан кейде базалық жұптардың енгізілуіне немесе жойылуына әкеледі, бұл оқырмандық қателік мутацияларына әкеледі. Бұл мутациялар олар кездесетін генді функционалды емес етеді, осылайша осы геннің нокаутын жасайды. Бұл процесс гомологты рекомбинацияға қарағанда тиімдірек, сондықтан оны биаллельді нокаут жасау үшін оңай қолдануға болады. ДНК байланысу аймағы, қажетті нысаналы ДНК тізбегінің бір негіз жұбын танитын аминқышқыл қайталауларынан тұрады. Егер бұл кесу геннің кодтау аймағына бағытталған болса және NHEJ арқылы жөндеу енгізілген және жойылған болса, онда көбінесе оқырмандық қателік мутациясы пайда болады, осылайша геннің функциясы бұзылады. Біріктірілген Cas9 ДНК-ның қос тізбекті үзілісін тудырады.
Homologous recombination is the exchange of genes between two DNA strands that include extensive regions of base sequences that are identical to one another. In eukaryotic species, bacteria, and some viruses, homologous recombination happens spontaneously and is a useful tool in genetically engineered. Homologous recombination, which takes place during meiosis in eukaryotes, is essential for the repair of double stranded DNA breaks and promotes genetic variation by allowing the movement of genetic information during chromosomal crossing. Homologous recombination, a key DNA repair mechanism in bacteria, enables the insertion of genetic material acquired through horizontal transfer of genes and transformation into DNA. Homologous recombination in viruses influences the course of viral evolution. Homologous recombination, a type of gene targeting used in genetic engineering, involves the introduction of an engineered mutation into a particular gene in order to learn more about the function of that gene. This method involves inserting foreign DNA into a cell that has a sequence similar to the target gene while being flanked by sequences that are the same upstream and downstream of the target gene. The target gene's DNA is substituted with the foreign DNA sequence during replication when the cell detects the similar flanking regions as homologues. The target gene is "knocked out" by the exchange. By using this technique to target particular alleles in embryonic stem cells in mice, it is possible to create knockout mice. With the aid of gene targeting, numerous mouse genes have been shut down, leading to the creation of hundreds of distinct mouse models of various human diseases, such as cancer, diabetes, cardiovascular diseases, and neurological disorders. Mario Capecchi, Sir Martin J. Evans, and Oliver Smithies performed groundbreaking research on homologous recombination in mouse stem cells, and they shared the 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine for their findings. Traditionally, homologous recombination was the main method for causing a gene knockout. This method involves creating a DNA construct containing the desired mutation. For knockout purposes, this typically involves a drug resistance marker in place of the desired knockout gene. The construct will also contain a minimum of 2kb of homology to the target sequence. The construct can be delivered to stem cells either through microinjection or electroporation. This method then relies on the cell's own repair mechanisms to recombine the DNA construct into the existing DNA. This results in the sequence of the gene being altered, and most cases the gene will be translated into a nonfunctional protein, if it is translated at all. However, this is an inefficient process, as homologous recombination accounts for only 10−2 to 10−3 of DNA integrations. This may be done imperfectly, therefore sometimes causing insertions or deletions of base pairs, which cause frameshift mutations. These mutations can render the gene in which they occur nonfunctional, thus creating a knockout of that gene. This process is more efficient than homologous recombination, and therefore can be more easily used to create biallelic knockouts. The DNA binding region consists of amino acid repeats that each recognize a single base pair of the desired targeted DNA sequence. If this cleavage is targeted to a gene coding region, and NHEJ mediated repair introduces insertions and deletions, a frameshift mutation often results, thus disrupting function of the gene. The coupled Cas9 will cause a double stranded break in the DNA.
Қосылған
Генді енгізу генді жоюға ұқсас, бірақ ол генді жоймай, басқа генмен алмастырады.
Gene knock in is similar to gene knockout, but it replaces a gene with another instead of deleting it.
Шартты нокауттар
Шартты ген нокауты генді тіндерде, тіндерге тәндей жоюға мүмкіндік береді. Бұл, егер геннің толық жойылуы (null мутациясы) эмбрионның өліміне әкелсе, немесе нақты бір тінді немесе жасуша түрін зерттеу маңызды болса, ген нокаутының орнына қолданылады. Бұл геннің айналасына loxP сайттары деп аталатын қысқа тізбектерді енгізу арқылы іске асырылады. Бұл тізбектер гендік желіге (germ line) нокаутпен ұқсас механизм арқылы енгізіледі. Содан кейін, бұл гендік желі Cre рекомбиназасын қамтитын басқа гендік желімен будастастырылады. Cre рекомбиназасы – бұл тізбектерді танитын, оларды рекомбинациялайтын және осы сайттармен шектелінген генді жоятын вирустық фермент. Ерте дамуға қатысы жоқ гендер генді жою арқылы жасалған нокаут әдістерін пайдаланып тиімді зерттелді. Дегенмен, организмге өлімге әкелмей, ерте даму кезінде белсенді гендерді жою әдетте мүмкін емес. Осы мәселені шешудің бір жолы – шартты нокаут. Cre деп аталатын сайтқа қатысты рекомбиназаны пайдалану арқылы, алғашқы шартты нокаут әдісі LoxP деп аталатын қысқа нысана тізбектерін рекомбинациялады. Содан бері басқа рекомбиназалар жасалып, шартты нокаут эксперименттерінде қолданылып келеді.
A conditional gene knockout allows gene deletion in a tissue in a tissue specific manner. This is required in place of a gene knockout if the null mutation would lead to embryonic death, or a specific tissue or cell type is of specific interest. This is done by introducing short sequences called loxP sites around the gene. These sequences will be introduced into the germ line via the same mechanism as a knockout. This germ line can then be crossed to another germline containing Cre recombinase which is a viral enzyme that can recognize these sequences, recombines them and deletes the gene flanked by these sites. Genes not involved in early development have been effectively studied using knockout approaches that use gene deletion. However, it is typically not possible to knock off genes that are active during early development without the organism suffering a fatal outcome. One method around this is conditional knockout. Utilizing a site specific recombinase called Cre, the original conditional knockout technique recombined short target sequences known as LoxP. Since then, other recombinases have been created and employed in conditional knockout experiments.
Қолдану
Нокауттар негізінен белгілі бір геннің немесе ДНК аймағының қызметін анықтау үшін қолданылады, осы үшін нокаут организмді ұқсас генетикалық фонға ие жабайы типпен салыстырады. Нокаут организмдері сондай-ақ дәрі-дәрмектерді әзірлеу кезінде скрининг құралдары ретінде пайдаланылады, нақты нокаутты қолдану арқылы белгілі бір биологиялық процестерді немесе жетіспеушіліктерді анықтауға, немесе бүкіл геномды қамтитын нокаут организмдерінің жиынтығын пайдалану арқылы дәрі-дәрмектің әсер ету механизмін түсінуге болады, мысалы, Saccharomyces cerevisiae ішінде.
Knockouts are primarily used to understand the role of a specific gene or DNA region by comparing the knockout organism to a wildtype with a similar genetic background. Knockout organisms are also used as screening tools in the development of drugs, to target specific biological processes or deficiencies by using a specific knockout, or to understand the mechanism of action of a drug by using a library of knockout organisms spanning the entire genome, such as in Saccharomyces cerevisiae.