Кіріспе

Ұяшық ішіндегі шағын ДНК молекуласы – плазмид. Плазмид – ұяшық ішіндегі, хромосомалық ДНК-дан физикалық жағынан бөлінген және өздігінен көбейе алатын шағын ДНК молекуласы. Олар көбінесе бактерияларда кішкентай, дөңгелек, қос тізлімді ДНК молекулалары түрінде кездеседі, бірақ плазмидтер кейде археяларда және эукариоттық организмдерде де болады. Табиғатта плазмидтер көбінесе организмнің тірі қалуына көмектесетін және антибиотикке төзімділік сияқты селективті артықшылықтарды қамтамасыз ететін гендерді тасымалдайды. Хромосомалар үлкен және қалыпты жағдайларда тірі қалу үшін қажетті барлық генетикалық ақпаратты қамтиды, ал плазмидтер әдетте өте кішкентай болады және тек белгілі бір жағдайларда немесе ортада пайдалы болатын қосымша гендерді ғана қамтиды. Жасанды плазмидтер молекулалық клондауда кеңінен векторлар ретінде қолданылады, ол ие организмдердегі рекомбинантты ДНК тізбектерінің көбейе түсуін қамтамасыз етеді. Зертханада плазмидтер трансформация арқылы жасушаға енгізілуі мүмкін. Синтетикалық плазмидтерді интернеттен сатып алуға болады. Плазмидтер репликон болып саналады, яғни қолайлы иесінде автономды түрде көбейе алатын ДНК бірліктері. Дегенмен, вирустар сияқты плазмидтер де әдетте тірі организмдерге жатпайды. Плазмидтер бір бактериядан екіншісіне (тіпті басқа түрге де) көбінесе конъюгация арқылы беріледі. Генетикалық материалдың иеден иеге ауысуы – гендердің көлденең тасымалдануының бір механизмі және плазмидтер мобиломның бір бөлігі болып саналады. Вирустардан айырмашылығы, олар өз генетикалық материалдарын капсид деп аталатын қорғаныш ақуыз қабығына орайды, плазмидтер "жалаңаш" ДНК болып табылады және жаңа иеге беру үшін генетикалық материалды орауға қажетті гендерді кодтамайды; алайда, плазмидтердің кейбір түрлері өздерінің тасымалдануы үшін қажетті конъюгативтік "жыныстық" пилусті кодтайды. Плазмидтердің мөлшері 1-ден 400 кб/с-қа дейін өзгереді, ал бір жасушадағы бірдей плазмидтердің саны кейбір жағдайларда бірден мыңға дейін жете алады.

Тарих

Плазмид термині 1952 жылы американдық молекулалық биолог Джошуа Ледербергпен «кез келген хромосомадан тыс мұрагерлік анықтама» деп аталып енгізілді. Терминнің алғашқы қолданылуы, репликация циклінің кем дегенде бір бөлігі үшін хромосомадан тыс болатын кез келген бактериялық генетикалық материалды қамтыды, бірақ бұл сипаттама бактериялық вирустарды да қамтитындықтан, плазмид түсінігі уақыт өте келе автономды түрде көбейтілетін генетикалық элементтерді қамту үшін нақтыланды. Вирустардан ажырату мақсатында, анықтама хромосомадан тыс немесе басым түрінде болатын және өздігінен көбейе алатын генетикалық элементтермен шектелді. Плазмидтерде әрқашан кем дегенде бір ген болады. Плазмидтермен тасымалданатын көптеген гендер қабылдаушы жасушалар үшін пайдалы, мысалы, қабылдаушы жасушаның өсуіне кедергі келтіретін немесе өлімге әкелетін ортада тірі қалуына мүмкіндік береді. Бұл гендердің кейбіреулері антибиотиктерге немесе ауыр металдарға төзімділік қасиеттерін кодтайды, ал басқалары бактерияның иесін отарлауға және оның қорғанысын жеңуге мүмкіндік беретін вируленттілік факторларын шығарады немесе бактерияның белгілі бір қоректік затты пайдалануға мүмкіндік беретін нақты метаболикалық функцияларды атқарады, соның ішінде қиын ыдырайтын немесе уытты органикалық қосылыстарды ыдырату қабілеті бар. Плазмидтер бактерияларға азотты бекіту қабілетін де сыйлайды. Дегенмен, кейбір плазмидтердің қабылдаушы жасушаның фенотипіне байқалатын әсері жоқ немесе қабылдаушы жасушаларға тигізетін пайдасы анықталмайды, мұндай плазмидтер криптикалық плазмидтер деп аталады. Табиғи плазмидтер физикалық қасиеттері бойынша әртүрлі болады. Олардың мөлшері 1 килобазалық жұптан (kbp) кем шағын плазмидтерден бірнеше мегабазалық жұптан (Mbp) асатын ірі мегаплазмидтерге дейін өзгеруі мүмкін. Ең ірілерінде мегаплазмид пен минихромосома арасындағы айырмашылық шамалы. Плазмидтер көбінесе дөңгелек пішіндес, бірақ сызықтық плазмидтердің мысалдары да белгілі. Бұл сызықтық плазмидтер өз ұштарын көбейту үшін арнайы механизмдерді қажет етеді. Плазмидтер жеке жасушада әртүрлі санда болуы мүмкін, бірден бірнеше жүзге дейін. Бір жасушада кездесетін плазмид көшірмелерінің қалыпты саны плазмид көшірме саны деп аталады және ол репликацияның басталуын қалай реттелетінімен және молекуланың мөлшерімен анықталады. Ірі плазмидтерде көшірме саны көбінесе аз болады. Сызықтық пішіндес плазмидтер фитопатогендер арасында сирек кездеседі, бір ғана ерекшелік – Rhodococcus fascians.

Жіктеу және түрлері

Плазмидтерді бірнеше тәсілмен жіктеуге болады. Плазмидтерді жалпы алғанда конъюгациялық плазмидтер мен конъюгациялық емес плазмидтерге жіктеуге болады. Конъюгациялық плазмидтер әртүрлі жасушалар арасындағы жыныстық конъюгацияны қамтамасыз ететін трансфер гендерінің жиынтығын қамтиды. Конъюгациялық емес плазмидтер конъюгацияны бастауға қабілетсіз, сондықтан оларды тек конъюгациялық плазмидтердің көмегімен ғана тасымалдауға болады. Плазмидтердің аралық класы – мобилизацияланатын плазмидтер, олар тасымалдау үшін қажетті гендердің тек бір бөлігін ғана алып жүреді. Олар конъюгациялық плазмидке паразиттей біріге алады және тек оның қатысуында ғана жоғары жиілікпен тасымалданады. Плазмидтерді үйлесімсіздік топтарына да жіктеуге болады. Микроб әртүрлі типтегі плазмидтерді қамти алады, бірақ әртүрлі плазмидтер бір бактериялық жасушада тек үйлесімді болған жағдайда ғана қатар өмір сүре алады. Егер екі плазмид үйлесімсіз болса, олардың біреуі немесе екеуі де жасушадан жылдам жоғалады. Сондықтан, әртүрлі плазмидтерді бір-бірімен бірге өмір сүре алу мүмкіндігіне қарай әртүрлі үйлесімсіздік топтарына жатқызуға болады. Үйлесімсіз плазмидтер (бір үйлесімсіздік тобына жататындар) әдетте бірдей репликация немесе бөліну механизмдерін бөліседі және сондықтан бір жасушада бірге сақтау мүмкін емес. Плазмидтерді функциясы бойынша жіктеудің тағы бір жолы бар. Негізгі бес класс бар: фертильділік F плазмидтері, олар tra гендерін қамтиды. Олар конъюгацияға қабілетті және жыныстық пилидің (pili) пайда болуына себеп болады. Резистенттілік (R) плазмидтері, олар антибиотиктерге немесе антибактериялық заттарға қарсы тұруды қамтамасыз ететін гендерді қамтиды. Плазмидтердің табиғаты түсініксіз болған кезде бұрын R факторлары деп белгіленген. Col плазмидтері, олар басқа бактерияларды өлтіре алатын ақуыздар – бактериоциндерді кодтайтын гендерді қамтиды. Деградациялық плазмидтер, олар толуол және салицил қышқылы сияқты ерекше заттарды ыдыратуға мүмкіндік береді. Вирулентті плазмидтер бактерияны патогенге айналдырады, мысалы, Agrobacterium tumefaciens бактериясындағы Ti плазмиді.

Плазмидтер осы функционалдық топтардың бірінен көбіне жатуы мүмкін.

РНК плазмидтері

Плазмидтердің көпшілігі қос жіпті ДНК молекулалары болғанымен, кейбіреулері бір жіпті ДНК-дан немесе басым түрінде қос жіпті РНК-дан тұрады. РНК плазмидтері – балдырлардан бастап құрлықтағы өсімдіктерге дейін саңырауқұлақтар мен әртүрлі өсімдіктерде кездесетін, қапталған және қапталмаған, жұқпалы емес, хромосомадан тыс сызықтық РНК көбейгіштері. Дегенмен, көп жағдайда РНК плазмидтерін РНК вирустары мен басқа жұқпалы РНК-дан нақты ажырату қиын немесе мүмкін болмайды.

Хромидтер

Хромидтер – хромосома мен плазмида арасындағы шекарада кездесетін элементтер, 2009 жылға дейін тізбектелген бактерия түрлерінің шамамен 10%-ында табылған. Бұл элементтер маңызды гендерді тасымалдайды және хромосомаға ұқсас кодондық қолданысқа ие, бірақ плазмида типтес репликация механизмін пайдаланады, мысалы, RepABC жүйесі арқылы көшірмелердің аз санын қамтамасыз етеді. Осының салдарынан, олар бұрын минихромосомалар немесе мегаплазмидтер деп әртүрлі жіктеліп келген. Вибрио бактериясында хромосома мен хромидтің репликациясы геном мөлшерінің сақталатын арақатынасы арқылы синхрондалады.

Векторлар

Жасанды плазмидтер генетикалық инженерияда векторлар ретінде қолданылуы мүмкін. Бұл плазмидтер генетика және биотехнология зертханаларында маңызды құралдар болып табылады, олар көбінесе гендерді клондау және көбейту (көптеген көшірмелер жасау) немесе белгілі бір гендерді экспрессиялау үшін пайдаланылады. Мұндай мақсаттар үшін кең ауқымда плазмидтер коммерциялық түрде қол жетімді. Көшірілуі тиіс ген әдетте, олардың қолданылуы үшін қажетті бірқатар ерекшеліктері бар плазмидке енгізіледі. Оларға белгілі бір антибиотиктерге (бактериялық штаммдар үшін ең көп қолданылатыны ампициллин) қарсы тұру қабілетін қамтамасыз ететін ген, бактериялық жасушаларға плазмид ДНК-сын көбейтуге мүмкіндік беретін репликацияның басталу нүктесі және клондауға қолайлы орын (көптік клондау орны деп аталады) кіреді. ДНК-ның құрылымдық тұрақсыздығы – генетикалық материалдың күтпеген қайта құрылуына, жоғалуына немесе пайда болуына әкелетін спонтанды оқиғалар тізбегі ретінде анықталады. Мұндай оқиғалар көбінесе жылжымалы элементтердің транслокациясы немесе канондық емес (B емес) құрылымдар сияқты тұрақсыз элементтердің болуынан туындайды. Бактериялық "тірекшеге" жататын қосымша аймақтар құрылымдық тұрақсыздық құбылыстарының кең спектріне қатысуы мүмкін. Генетикалық тұрақсыздықтың белгілі катализаторларына тікелей, инвертті және тандемдік қайталанулар жатады, олар көптеген коммерциялық клондау және экспрессия векторларында кең таралған. Инсерциялық тізбектер де плазмид функциясына және өнімділігіне елеулі әсер етуі мүмкін, жоюлар мен қайта құрылымдануларға, сондай-ақ жақын орналасқан гендердің экспрессиясын белсендіруге, төмендетуге немесе тоқтатуға әкелуі мүмкін. Сондықтан, қажетсіз кодтамайтын "тірекше" тізбектерін азайту немесе толық жою мұндай оқиғалардың болу мүмкіндігін және, демек, плазмидтің жалпы рекомбинациялық потенциалын айтарлықтай төмендетеді.

Клондау

Плазмидтер – бактерияларды клондау үшін ең көп қолданылатын векторлар. Бұл клондау векторларында ДНК фрагменттерін енгізуге мүмкіндік беретін арнайы орын бар, мысалы, көптеген клондау орындары немесе полилинкер, онда ДНК фрагменттерін қосуға болатын бірнеше жиі қолданылатын шектеу ферменттерінің орындары бар. Қызығушылық тудыратын ген енгізілгеннен кейін плазмидтер трансформация деп аталатын процесте бактерияларға енгізіледі. Бұл плазмидтерде таңдау маркері болады, әдетте антибиотикке төзімділік гені, ол бактерияларға белгілі бір антибиотиктер бар селективті ортада тірі қалуға және көбейуге мүмкіндік береді. Трансформациядан кейін жасушалар селективті ортаға ұшыратылады және плазмидті қамтитын жасушалар ғана тірі қалады. Осылайша, антибиотиктер плазмидтік ДНК-ны қамтитын бактерияларды ғана іріктеуге арналған сүзгі ретінде әрекет етеді. Векторда клондалған енгізілген фрагменттері бар плазмидтерді таңдауды жеңілдету үшін басқа маркерлік гендер немесе репортерлік гендер де болуы мүмкін. Плазмидті қамтитын бактерияларды көп мөлшерде өсіріп, жинап, плазмид дайындаудың әртүрлі әдістерін қолдана отырып, қажетті плазмидті оқшаулауға болады. Плазмидтік клондау векторы әдетте 15 кб дейінгі ДНК фрагменттерін клондау үшін қолданылады. ДНК-ның ұзын фрагменттерін клондау үшін лизогениялық гендері жойылған ламбда-фаг, космоидтар, бактериялық жасанды хромосомалар немесе ашытқының жасанды хромосомалары қолданылады.

Белсенің өндірісі

Плазмидтердің тағы бір маңызды қолданылуы – көп мөлшерде ақуыз жасау. Осы жағдайда зерттеушілер қызығушылық тудыратын гені бар плазмидтің көмегімен бактерияларды өсіреді. Бактерия антибиотикке қарсы тұру үшін ақуыздар өндіретіндей, сондай-ақ енгізілген геннен көп мөлшерде ақуыз өндіруге итермеленуі мүмкін. Бұл ген кодтайтын ақуызды, мысалы инсулинді, көптеп өндірудің арзан әрі оңай жолы.

Гендік терапия

Плазмидтер гендік терапияда генді жеткізу үшін де қолданылуы мүмкін, осылайша жасушаларда жетіспейтін белокты өндіруге мүмкіндік береді. Гендік терапияның кейбір түрлері адам геномындағы алдын ала таңдалған хромосомалық нысаналарға емдік гендерді енгізуді талап етеді. Плазмидтік векторлар – осы мақсатқа қолданылатын көптеген әдістердің бірі. Цинк саусақты нуклеазалар (ZFN) ДНК геномында нақты бір жерде қос тізбекті үзуді тудырып, гомологты рекомбинацияны ынталандырады. ZFN-ды кодтайтын плазмидтер емдік генді нақты бір орынға жеткізуге көмектеседі, соның арқасында жасушаларға зақым келтіру, қатерлі ісік тудыратын мутациялар немесе иммундық реакцияның алдын алуға болады.

Аурудың үлгілері

Плазмидтер тарихи тұрғыдан кеміргіштердің эмбрионалдық шешек жасушаларын генетикалық түрлендіру үшін, кеміргіштердің генетикалық ауруларының модельдерін жасауға қолданылып келді. Плазмид негізгі техникалардың тиімділігінің шектеулі болуы, оларды дәлірек адам жасушаларының модельдерін жасау үшін пайдалануға мүмкіндік бермеді. Дегенмен, адено-ассоциялы вирустық рекомбинация техникасы мен мырыш саусақты нуклеазалардың жетілуі, жаңа буын изогендік адам ауруының модельдерін құруға жағдай жасады.

Эпизомалар

Эпизома термині 1958 жылы Франсуа Якоб пен Эли Воллман тарапынан хромосомадан тыс генетикалық материалды, автономды түрде көбейе алатын немесе хромосомаға еніге алатын материалды белгілеу үшін енгізілді. Алайда, термин енгізілгеннен бері оның қолданылуы өзгерді, себебі плазмид автономды түрде көбейетін хромосомадан тыс ДНК үшін басым терминге айналды. 1968 жылы Лондонда өткен симпозиумда кейбір қатысушылар эпизома терминін қолдануды тоқтатуды ұсынды, бірақ басқалары мағынасы өзгергенмен оны қолдануды жалғастырды. Бүгінде кейбір авторлар эпизома терминін прокариоттар контекстінде хромосомаға енуге қабілетті плазмидті атау үшін қолданады. Интегративті плазмидтер жасушада бірнеше буын бойы көбейіп, тұрақты сақталуы мүмкін, бірақ белгілі бір кезеңде тәуелсіз плазмид молекуласы ретінде танылады. Эукариоттар контекстінде эпизома термині ядрода көбейтіле алатын, енбеген хромосомадан тыс жабық сақина тәрізді ДНК молекуласын білдіреді. Вирустар, мысалы герпесвирустар, аденовирустар және полиомавирустар осыған ең көп таралған мысалдар, бірақ кейбіреулері плазмидтер болып табылады. Басқа мысалдарға жасанды гендік амплификация немесе патологиялық процестер (мысалы, қатерлі жасушаның трансформациясы) кезінде пайда болатын аберрантты хромосомалық фрагменттер, мысалы, қос минуттық хромосомалар жатады. Эукариоттардағы эпизомалар прокариоттардағы плазмидтер сияқты ДНК-ның тұрақты сақталуын және жасушамен бірге көбейтілуін қамтамасыз етеді. Цитоплазмалық вирустық эпизомалар (мысалы, поксвирустық инфекцияларда) да кездеседі. Кейбір эпизомалар, мысалы герпесвирустар, бактериофагтарға (бактериялық фаг вирустары) ұқсас, дөңгелек тәрізді көбейту механизмі арқылы көбейеді. Басқалары екі бағытты көбейту механизмі (Theta типті плазмидтер) арқылы көбейеді. Екі жағдайда да эпизомалар жасуша хромосомаларынан физикалық жағынан бөлек болады. Эпштейн-Барр вирусы және Капоши саркомасымен байланысты герпес вирусы сияқты бірнеше қатерлі ісік вирустары қатерлі жасушаларда жасырын, хромосомалық жағынан ерекше эпизомалар ретінде сақталады, онда вирустар қатерлі жасушалардың көбеюіне ықпал ететін онкогендерді экспресс етеді. Қатерлі ісіктерде бұл эпизомалар жасуша бөлінетін кезде жасуша хромосомаларымен бірге пассивті түрде көбейеді. Бұл вирустық эпизомалар литикалық көбейтуді бастап, көптеген вирус бөлшектерін тудырғанда, әдетте жасушаның туа біткен иммундық қорғаныс механизмдерін белсендіреді, бұл жасушаның өліміне әкеледі.

Плазмидті күтіп ұстау

Кейбір плазмидтер немесе микробтық қабылдаушылар арасында, мысалы, Escherichia coli бактериясындағы R1 плазмидінің hok/sok (қонақшаны өлтіру/өлтіруді тежеу) жүйесі сияқты тәуелділік жүйесі немесе постсегрегациялық өлтіру жүйесі (PSK) кездеседі. Бұл нұсқасы ұзақ сақталатын у және қысқа мерзімді антидот өндіреді. Плазмидтік тәуелділік жүйелерінің бірнеше түрі (токсин/антитоксин, метаболизмге негізделген, ОРТ жүйелері) әдебиетте сипатталған және биотехнологиялық (ферментация) немесе биомедициналық (вакциналық терапия) қолданыстарда қолданылған. Плазмидтің көшірмесін сақтап қалған жас клеткалар тірі қалады, ал плазмидті мұраға алмаған жас клеткалар өледі немесе аналық клеткадан қалған удың әсерінен өсу жылдамдығы төмендейді. Нәтижесінде, жалпы өнімділікті жақсартуға болады. Керісінше, биотехнологияда қолданылатын плазмидтер, мысалы, pUC18, pBR322 және олардан туындаған векторлар, токсин-антитоксин тәуелділік жүйелерін сирек қамтиды, сондықтан плазмидтердің жоғалуын болдырмау үшін антибиотиктермен ұстап тұру қажет.

Өсімдіктердің митохондриялық плазмидтері

Көптеген жоғары сатыдағы өсімдіктердің митохондриясында өздігінен көбейетін, хромосомадан тыс сызықтық немесе дөңгелек ДНК молекулалары бар, олар плазмидтер деп есептеледі. Олардың мөлшері 0,7 кб-тан 20 кб-ға дейін ауыспайды. Плазмидтер көбінесе екі санатқа бөлінеді: дөңгелек және сызықтық. Дөңгелек плазмидтер көптеген түрлі өсімдіктерде оқшауланды, олардың ішінде Vicia faba және Chenopodium album ең көп зерттелген, олардың көбею механизмі белгілі. Дөңгелек плазмидтер репликацияның θ моделі (Vicia faba-да) және дөңгелек репликация (C. album-да) арқылы көбейе алады. Сызықтық плазмидтер кейбір өсімдік түрлерінде, мысалы, Beta vulgaris, Brassica napus, Zea mays және т.б. анықталды, бірақ олар дөңгелек плазмидтерге қарағанда сирек кездеседі. Бұл плазмидтердің функциясы мен шығу тегі көбінесе белгісіз болып қалады. Дөңгелек плазмидтердің ортақ ата-тегі болуы мүмкін деген ұсыныс бар, митохондриялық плазмидтегі кейбір гендердің ядролық ДНҚ-дағы баламалары бар, бұл бөлімдер арасындағы ген алмасуға нұсқайды. Ал сызықтық плазмидтер вирустық ДНҚ-мен инвертрондар сияқты құрылымдық ұқсастықтарды бөліседі, сондай-ақ саңырауқұлақ плазмидтеріне ұқсас, төмен GC мазмұнына ие. Бұл байқаулар кейбір сызықтық плазмидтердің вирустық тегі болуы немесе патогендік саңырауқұлақтардан горизонтальды гендердің тасымалдануы арқылы өсімдік митохондриясына енгені туралы гипотезаларға әкелді.

Плазмидтік ДНК экстракциясы

Плазмидтер көбінесе нақты бір тізбекті тазарту үшін қолданылады, себебі оларды геномның қалған бөлігінен оңай бөліп алуға болады. Вектор ретінде қолдану және молекулалық клондау үшін плазмидтерді оқшаулау жиі қажет. Бактериялардан плазмидтік ДНК-ны оқшаулаудың бірнеше әдісі бар, минипрептен максипрепке немесе көп мөлшерлі препке дейін.

Плазмидтер жинағы

Көптеген плазмидтер жылдар бойы құрастырылды және зерттеушілер оларды Addgene және BCCM/LMBP сияқты коммерциялық емес ұйымдармен қоса плазмидтер базаларына тапсырды. Зерттеу мақсатында осы базалардан плазмидтерді табуға және сұрап алуға болады. Зерттеушілер сондай-ақ плазмидтердің нуклеотидтік тізбектерін NCBI дерекқорына жүктеп жатады, онда нақты плазмидтердің тізбектерін табуға мүмкіндік бар.