Электрондық микроскоптар: түрлері мен тарихы

Кіріспе

Жарық көзі ретінде электрондарды пайдаланатын микроскоптың түрі

Электронды микроскоп – жарық көзі ретінде электрон сәулесін пайдаланатын микроскоп. Олар электронды сәулені басқару үшін, мысалы, үлкейтілген кескіндерді немесе электронды дифракциялық суреттерді алу үшін оларды шоғырландыру үшін оптикалық жарық микроскобының шыны линзаларына ұқсас электрондық оптиканы қолданады. Электронның толқын ұзындығы көрінетін жарықтан 100 000 есеге дейін кішірек болуы мүмкін болғандықтан, электронды микроскоптардың ажыратымдылығы шамамен 0,1 нм-ге жетеді, ал жарық микроскоптары үшін бұл көрсеткіш шамамен 200 нм-ді құрайды. Электронды микроскоптар мыналарды қамтиды:
Трансмиссиялық электронды микроскопия (TEM) – жылдам электрондар жұқа үлгі арқылы өтеді;
Сканерленген электронды микроскопия (STEM) – сканерленген электронды зондты пайдаланатын TEM-ге ұқсас;
Сканерленген электронды микроскоп (SEM) – STEM-ге ұқсас, бірақ қалың үлгілермен жұмыс жасайды;
Электронды микрозонд – SEM-ге ұқсас, бірақ көбінесе химиялық талдау үшін қолданылады;
Жылдам сканерленген электронды микроскопия – өте жылдам жұмыс істей алатын SEM-нің түрі;
Төмен энергиялы электронды микроскопия (LEEM) – беттерді бейнелеу үшін қолданылады;
Фотоэмиссиялық электронды микроскопия (PEEM) – фотондармен беттерден шығарылған электрондарды пайдаланатын LEEM-ге ұқсас.
Қосымша мәліметтер жоғарыдағы сілтемелерде табылады. Бұл мақалада негізінен трансмиссиялық электронды микроскоптар туралы жалпы ақпарат келтірілген.

Тарих

Көптеген жаңалықтар микроскоптарда қолданылатын электрондық оптиканың негізін қалады. 1883 жылы Герцтің жұмысы маңызды қадам болды, ол электростатикалық және магниттік бұрылыспен катодты сәуле түтігін жасап, электрон сәулесінің бағытын басқаруды көрсетті. Басқаларының арасында 1899 жылы Эмиль Вихерттің осьтік магниттік өріс арқылы электрондарды шоғырландыруы, 1905 жылы Артур Венелттің көбірек электрондар шығаратын тотықты катодтарды жақсартуы және 1926 жылы Ханс Буштың электромагниттік линзаны дамытуы болды. Деннис Габордың айтуынша, физик Лео Силард 1928 жылы оны электронды микроскоп жасауға көндіруге тырысқан, өйткені Силард патент алған еді. Бүгінгі күнге дейін электронды микроскопты кім ойлап тапқаны туралы мәселе даулы болып қалуда. 1928 жылы Берлин техникалық университетінде Адольф Маттиас (Жоғары кернеу технологиясы және электр орналымдарының профессоры) Макс Кнолді электрондық сәулелер мен катодты сәулелі осциллоскоптарды зерттеуді дамыту үшін зерттеушілер тобын басқаруға тағайындады. Топқа бірнеше докторанттар кірді, соның ішінде Эрнст Руска да бар. 1931 жылы Макс Кнолл мен Эрнст Руска анодтың апертурасының үстіне орналасқан торлардың үлкейтілген кескіндерін жасауға сәттілікке жетті. Суретте көрсетілген құрылғының көшірмесі жоғары үлкейтуге екі магниттік линзаны қолданды, бұл алғашқы электронды микроскоп болды. (Макс Кнолл 1969 жылы қайтыс болды, сондықтан 1986 жылы электронды микроскоптарды ойлап тапқаны үшін берілген Нобель сыйлығының үлесін алмады.) Бұл күш-жігерге тәуелсіз жұмыс Рейнхольд Рюденбергтің Siemens Schuckert-тегі жұмысы болды. Патент заңнамасына сәйкес (АҚШ патенттері No. 2058914 және 2070318, екеуі де 1932 жылы тіркелген), ол электронды микроскопты ойлап тапқан, бірақ оның жұмыс істейтін құралы қашан болғаны белгісіз. Ол 1932 жылы жарияланған өте қысқа мақаласында Siemens 1932 жылы патенттерді тіркеуден бұрын бірнеше жыл бойы осы мәселе бойынша жұмыс істегенін, оның күш-жігері университеттегі дамумен параллель болғанын мәлімдеді. Ол 1961 жылы қайтыс болды, сондықтан Макс Кнолл сияқты 1986 жылғы Нобель сыйлығының үлесіне ие бола алмады. Келесі жылы, 1933 жылы, Руска мен Кнолл оптикалық (жарық) микроскоптың ажыратымдылығынан асып түсетін алғашқы электронды микроскопты жасады. Төрт жылдан кейін, 1937 жылы, Siemens Эрнст Руска мен Бодо фон Бористің жұмысын қаржыландырып, Эрнсттің інісі Гельмут Русканы микроскоптың, әсіресе биологиялық үлгілерге қолданылуын дамыту үшін жұмысқа алды. Сондай-ақ 1937 жылы Манфред фон Арденне сканерлік электронды микроскопты дамытты. Siemens 1938 жылы алғашқы коммерциялық электронды микроскопты өндірді. Солтүстік Америкадағы алғашқы электронды микроскоптар 1930-шы жылдары Вашингтон штаты университетінде Андерсон мен Фицсиммонс, ал Торонто университетінде Эли Франклин Бертон және студенттер Сесил Холл, Джеймс Хиллер және Альберт Пребус жасады. Siemens 1939 жылы трансмиссиялық электронды микроскоп (ТЭМ) өндірді. Қазіргі трансмиссиялық электронды микроскоптар екі миллион есеге дейін үлкейтуге қабілетті болғанымен, ғылыми құралдар ретінде олар жақсартылған оптикасымен бірге ұқсас күйде қалуда.

Many developments laid the groundwork of the electron optics used in microscopes. One significant step was the work of Hertz in 1883 who made a cathode ray tube with electrostatic and magnetic deflection, demonstrating manipulation of the direction of an electron beam. Others were focusing of the electrons by an axial magnetic field by Emil Wiechert in 1899, improved oxide coated cathodes which produced more electrons by Arthur Wehnelt in 1905 and the development of the electromagnetic lens in 1926 by Hans Busch. According to Dennis Gabor, the physicist Leó Szilárd tried in 1928 to convince him to build an electron microscope, for which Szilárd had filed a patent. To this day the issue of who invented the transmission electron microscope is controversial. In 1928, at the Technical University of Berlin, Adolf Matthias (Professor of High Voltage Technology and Electrical Installations) appointed Max Knoll to lead a team of researchers to advance research on electron beams and cathode ray oscilloscopes. The team consisted of several PhD students including Ernst Ruska. In 1931, Max Knoll and Ernst Ruska successfully generated magnified images of mesh grids placed over an anode aperture. The device, a replicate of which is shown in the figure, used two magnetic lenses to achieve higher magnifications, the first electron microscope. (Max Knoll died in 1969, so did not receive a share of the 1986 Nobel prize for the invention of electron microscopes.) Apparently independent of this effort was work at Siemens Schuckert by Reinhold Rüdenberg. According to patent law (U. S. Patent No. 2058914 and 2070318, both filed in 1932), he is the inventor of the electron microscope, but it is not clear when he had a working instrument. He stated in a very brief article in 1932 that Siemens had been working on this for some years before the patents were filed in 1932, claiming that his effort was parallel to the university development. He died in 1961, so similar to Max Knoll, was not eligible for a share of the 1986 Nobel prize. In the following year, 1933, Ruska and Knoll built the first electron microscope that exceeded the resolution of an optical (light) microscope. Four years later, in 1937, Siemens financed the work of Ernst Ruska and Bodo von Borries, and employed Helmut Ruska, Ernst's brother, to develop applications for the microscope, especially with biological specimens. Also in 1937, Manfred von Ardenne pioneered the scanning electron microscope. Siemens produced the first commercial electron microscope in 1938. The first North American electron microscopes were constructed in the 1930s, at the Washington State University by Anderson and Fitzsimmons and at the University of Toronto by Eli Franklin Burton and students Cecil Hall, James Hillier, and Albert Prebus. Siemens produced a transmission electron microscope (TEM) in 1939. Although current transmission electron microscopes are capable of two million times magnification, as scientific instruments they remain similar but with improved optics.

Трансмиссиялық электронды микроскоп (TEM)

Электрондық микроскоптың бастапқы түрі – трансмиссиялық электронды микроскоп (ТЭМ) – үлгіні жарықтандыру және кескін жасау үшін жоғары кернеулі электрондық сәулені пайдаланады. Электрондық сәуле электрондық қару арқылы жасалады, электрондар әдетте 40-ден 400 кВ-қа дейін энергиямен, электромагниттік линзалармен шоғырландырылып, үлгі арқылы өтеді. Үлгіден шыққанда электрондық сәуле микроскоптың линзаларымен ұлғайтылған үлгінің құрылымы туралы ақпаратты тасиды. Бұл ақпараттың кеңістіктегі өзгеруі ("кескін") ұлғайтылған электрондық кескінді детекторға проекциялау арқылы көрінеді. Мысалы, оператор кескінді мырыш сульфиді сияқты сцинтиллятор материалымен жабылған флуоресценттік экран арқылы тікелей көре алады. Жоғары ажыратымдылыққа ие фосфор линзалық оптикалық жүйе немесе оптикалық талшықты жарық жетекші арқылы цифрлық камераның сенсорымен байланыстырылуы мүмкін. Тікелей электрондық детекторларда сцинтиллятор болмайды және олар электрондық сәулеге тікелей ұшырайды, бұл сцинтиллятормен байланыстырылған камералардың кейбір шектеулерін жояды. ТЭМ-нің ажыратымдылығы негізінен сфералық аберрациямен шектеледі, бірақ жаңа буын аппараттық түзетушілер сфералық аберрацияны азайтып, жоғары ажыратымдылықты трансмиссиялық электронды микроскопияда (ЖАЭМ) ажыратымдылықты 0,5 ангстремнен (50 пикометрден) төмендетуге мүмкіндік береді, бұл 50 миллионнан астам есе ұлғайтуға қол жеткізеді. ЖАЭМ-нің материалдардағы атомдардың орналасуын анықтау мүмкіндігі нанотехнологияларды зерттеу және әзірлеуде пайдалы. Трансмиссиялық электронды микроскоптар көбінесе электрондық дифракция режимінде қолданылады. Электрондық дифракцияның рентгендік кристаллографияға қарағанда артықшылығы – үлгі бір кристалл немесе тіпті поликристалл ұнтақ болуы міндетті емес.

Скандық электронды микроскоп (STEM)

STEM үлгі бойынша шоғырланған сәулелендіруді жүзеге асырады. ТЭМ-нің жоғары ажыратымдылығы STEM режимінде мүмкін болады. Фокусқа түсіру әрекеті (және аберрациялар) электрондар үлгіге тиіспей бұрын STEM-де, ал ТЭМ-де тигеннен кейін пайда болады. STEM-дегі СЭМ-ге ұқсас сәулелендіру растрлеуі шеңберлі қараңғы дала бейнелеуін және басқа да талдау техникаларын жеңілдетеді, бірақ бұл бейне деректері параллель емес, тізбектей жиналады дегенді білдіреді.

Скандеуші электронды микроскоп (СЭМ)

SEM суреттерді үлгіні шоғырланған электронды сәулемен зондтап, оны үлгі бойынша сканерлеу арқылы (растрлі сканерлеу) жасайды. Электронды сәуле үлгімен әрекеттескенде, түрлі механизмдер арқылы энергия жоғалтады. Жоғалған энергия жылуға, төмен энергиялы екінші электрондар мен жоғары энергиялы кері шашыраған электрондарға, жарық шығаруға (католюминесценция) немесе рентген сәулесіне айналады, олардың барлығы үлгі бетінің қасиеттері туралы ақпаратты тасымалдайтын сигналдарды береді, мысалы, оның топографиясы мен құрамы. SEM дисплейіндегі кескін осы сигналдардың кез келгенінің өзгеретін қарқындылығын сигнал туған кездегі үлгідегі сәуленің орнына сәйкес келетін позициядағы кескінге бейнелейді. Суретте көрсетілген құмырсқаның кескіні екінші электронды детектордан алынған сигналдардан құралған, бұл көптеген SEM-дердегі қалыпты немесе стандартты бейнелеу режимі. Әдетте, SEM кескінінің ажыратымдылығы TEM кескінінен төмен болады. Алайда, SEM үлгінің ішкі емес, бетін бейнелейтіндіктен, электрондар үлгі арқылы өтуі қажет емес. Бұл үлгіні электронды мөлдірлікке дейін жұқалату үшін кең ауқымды дайындық қажеттілігін азайтады. SEM сондай-ақ үлкен тереңдікке ие, сондықтан үлгінің үш өлшемді бет пішінін жақсы көрсететін суреттерді жасай алады. Көптеген конфигурацияларда электронды микроскоптар пикселге бір жарықтық мәні бар суреттерді жасайды, нәтижелер әдетте сұр түсті болады. Дегенмен, көбінесе бұл суреттер мүмкіндіктерді анықтау бағдарламалық жасақтамасын пайдалану арқылы немесе графикалық редакторды қолданып қолмен өңдеу арқылы түстіленеді. Бұл құрылымды нақтылау немесе эстетикалық әсер үшін жасалуы мүмкін және әдетте үлгі туралы жаңа ақпарат қоспайды.

ТЭМ үшін үлгілерді дайындау

Трансмиссиялық электронды микроскопта қаралатын материалдарға қолайлы үлгі алу үшін өңдеу қажет болуы мүмкін. Қажетті техника үлгіге және қажетті талдауға байланысты өзгереді: Химиялық бекіту – биологиялық үлгілер үшін бұл формальдегид және глютаральдегид сияқты альдегидтермен белоктарды, ал осмий тетроксидімен липидтерді химиялық байланыстыру арқылы үлгідегі қозғалмалы макромолекулалық құрылымды тұрақтандыруға бағытталған. Криофиксация – судың кристалдық емес, шыны тәрізді мұзға айналуы үшін үлгіні тоңдыру. Бұл оның табиғи күйін сақтап қалады. Бұл шынылануға жету әдістеріне сұйық этанға жылдам батыру және жоғары қысымда тоңдыру жатады. Осы техникадан криоэлектрондық микроскопия саласы туындаған. Көздік бөліктердің криоэлектрондық микроскопиясы (CEMOVIS) және ламеллаларды криофокусланған иондық сәулемен ұнтақтаудың дамуымен қазір кез келген биологиялық үлгіні оның табиғи күйіне жақын күйде байқауға болады. Сусыздану – суды этанол немесе ацетон сияқты органикалық еріткіштермен алмастыру, содан кейін сыныптық нүктеде кептіру немесе сіңдіру арқылы инфильтрациялау. Сондай-ақ мұздатып кептіруді қараңыз. Тігілу, биологиялық үлгілер – сусыздағаннан кейін, тінді электронды микроскопта бақылау үшін кіріктіреді, содан кейін оны қарауға дайын кесуге болады. Мұны істеу үшін тінді пропилен оксиді (эпоксипропан) немесе ацетон сияқты «өткінші еріткіш» арқылы өткізеді, содан кейін Аралдит, Эпон немесе Дуркупан сияқты эпоксидтік шайырмен инфильтрациялайды; тіндер тікелей сумен араласатын акрилді шайырға енгізілуі мүмкін. Шайыр полимерленгеннен (қатайтылғаннан) кейін үлгі ультрамикротомия арқылы кесіліп, боялады. Материалдарды тігу – шайырға енгізгеннен кейін, үлгі әдетте өте ұсақ абразивтерді қолдану арқылы айна тәрізді жылтырлыққа дейін ұнтақталады және жылтыратылады. Тоңазыту сынығы немесе тоңазыту этикасы – липидті мембраналарды және олардың құрамына кіретін ақуыздарды «бетке қарай» қарау үшін ерекше пайдалы дайындық әдісі. Жаңа тінді немесе жасуша суспензиясын жылдам тоңдырады (криофиксация), содан кейін сындыру арқылы (немесе микротомды пайдалану арқылы) сындырады. Иондық сәулемен ұнтақтау – үлгіні электрондарға мөлдір болғанға дейін иондарды (әдетте аргонды) бұрыштан атып, бетінен материалды шашырату арқылы жұқартады. Бұл техниканың бір түрі – фокусланған иондық сәулемен ұнтақтау, онда галлий иондары үлгінің белгілі бір аймағында, мысалы, микропроцессордың ішіндегі құрылым арқылы электрондарға мөлдір мембрананы немесе «ламелланы» жасау үшін қолданылады. Иондық сәулемен ұнтақтау механикалық ұнтақтау арқылы дайындау қиын материалдарды талдау алдында көлденең қималарды жылтырату үшін де қолданылуы мүмкін. Теріс бояу – нанобөлшектер немесе ұсақ биологиялық материалдар (вирустар мен бактериялар сияқты) бар суспензиялар аммоний молибдаты, уран ацетаты (немесе форматы) немесе фосфотунгстикалық қышқыл сияқты электронды мөлдір емес ерітіндінің сұйылтылған ерітіндісімен қысқа мерзімге араластырылады. Бұл қоспаны формавар сияқты пластикалық пленкамен алдын ала жабылған ЭМ торға жағып, сүртеді, содан кейін кептіруге қалдырады. Дайындықты ТМ-да қарауды дереу жүргізу керек, ең жақсы нәтиже алу үшін. Бұл әдіс микробиологияда жылдам, бірақ шикі морфологиялық сәйкестендіру үшін маңызды, сонымен қатар көміртекті пленкаларды қолдану арқылы ЭМ томография әдісін қолдана отырып, жоғары ажыратымды 3D реконструкцияның негізі ретінде де қолданылуы мүмкін. Нанобөлшектерді бақылау үшін теріс бояу да қолданылады. Кесу – электрондарға жартылай мөлдір үлгінің жұқа кесінділерін жасайды. Оларды шыны немесе алмаз пышақпен ультрамикротомада ультрамикротома арқылы 60–90 нм қалыңдықтағы өте жұқа кесінділерді алу үшін кесуге болады. Зертханада жасауға болатындықтан және олар әлдеқайда арзан болғандықтан, бір рет қолданылатын шыны пышақтар да қолданылады. Секцияларды сондай-ақ фокусланған иондық сәулемен SEM-де ұнтақтау арқылы in situ жасауға болады, онда секция ламелла деп аталады.

Materials to be viewed in a transmission electron microscope may require processing to produce a suitable sample. The technique required varies depending on the specimen and the analysis required:
Chemical fixation – for biological specimens this aims to stabilize the specimen's mobile macromolecular structure by chemical crosslinking of proteins with aldehydes such as formaldehyde and glutaraldehyde, and lipids with osmium tetroxide. Cryofixation – freezing a specimen so that the water forms vitreous (non crystalline) ice. This preserves the specimen in a snapshot of its native state. Methods to achieve this vitrification include plunge freezing rapidly in liquid ethane, and high pressure freezing. An entire field called cryo electron microscopy has branched from this technique. With the development of cryo electron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS) and cryo focused ion beam milling of lamellae, it is now possible to observe samples from virtually any biological specimen close to its native state. Dehydration – replacement of water with organic solvents such as ethanol or acetone, followed by critical point drying or infiltration with embedding resins. See also freeze drying. Embedding, biological specimens – after dehydration, tissue for observation in the transmission electron microscope is embedded so it can be sectioned ready for viewing. To do this the tissue is passed through a 'transition solvent' such as propylene oxide (epoxypropane) or acetone and then infiltrated with an epoxy resin such as Araldite, Epon, or Durcupan; tissues may also be embedded directly in water miscible acrylic resin. After the resin has been polymerized (hardened) the sample is sectioned by ultramicrotomy and stained. Embedding, materials – after embedding in resin, the specimen is usually ground and polished to a mirror like finish using ultra fine abrasives. Freeze fracture or freeze etch – a preparation method particularly useful for examining lipid membranes and their incorporated proteins in "face on" view. The fresh tissue or cell suspension is frozen rapidly (cryofixation), then fractured by breaking (or by using a microtome) There are also related methods which label the surface of etched cells and other replica labeling variations. Ion beam milling – thins samples until they are transparent to electrons by firing ions (typically argon) at the surface from an angle and sputtering material from the surface. A subclass of this is focused ion beam milling, where gallium ions are used to produce an electron transparent membrane or 'lamella' in a specific region of the sample, for example through a device within a microprocessor or a focused ion beam SEM. Ion beam milling may also be used for cross section polishing prior to analysis of materials that are difficult to prepare using mechanical polishing. Negative stain – suspensions containing nanoparticles or fine biological material (such as viruses and bacteria) are briefly mixed with a dilute solution of an electron opaque solution such as ammonium molybdate, uranyl acetate (or formate), or phosphotungstic acid. This mixture is applied to an EM grid, pre coated with a plastic film such as formvar, blotted, then allowed to dry. Viewing of this preparation in the TEM should be carried out without delay for best results. The method is important in microbiology for fast but crude morphological identification, but can also be used as the basis for high resolution 3D reconstruction using EM tomography methodology when carbon films are used for support. Negative staining is also used for observation of nanoparticles. Sectioning – produces thin slices of the specimen, semitransparent to electrons. These can be cut using ultramicrotomy on an ultramicrotome with a glass or diamond knife to produce ultra thin sections about 60–90 nm thick. Disposable glass knives are also used because they can be made in the lab and are much cheaper. Sections can also be created in situ by milling in a focused ion beam SEM, where the section is known as a lamella.

ЭМ жұмыс ағыны

Биологиялық үлгілерді алғашқы электронды микроскопия көбінесе жаңа қолжетімді жоғары ажыратымдылықты пайдаланып, сипаттамалық болды. Бұл диагностикалық электронды микроскопия сияқты әртүрлі қолданулар үшін қазір де орын алады. Дегенмен, электронды микроскоптар қазір көбінесе күрделі жұмыс ағындарында қолданылады, әрбір жұмыс ағыны әдетте үлгінің күрделі және/немесе сандық талдауын жүзеге асыруға мүмкіндік беретін бірнеше технологияларды қолданады. Төменде бірнеше мысал келтірілген, бірақ бұл толық тізім деп есептелмеуі керек. Жұмыс ағынын таңдау қолдануға және тиісті ғылыми сұрақтардың талаптарына, мысалы, ажыратымдылық, көлем, мақсатты молекуланың сипаты және т.б. байланысты болады. Мысалы, бір үлгінің бір аймағының жарық және электронды микроскопиядан алынған суреттерін екі тәсілдің деректерін байланыстыру үшін біріктіруге болады. Бұл әдетте флуоресценттік таңбаланған құрылым туралы жоғары ажыратымдылықтағы контексттік ЭМ ақпаратын ұсыну үшін қолданылады. Бұл коррелятивті жарық және электронды микроскопия (CLEM) қазіргі кезде қолжетімді коррелятивті жұмыс ағындарының бірі болып табылады. Тағы бір мысал – жоғары ажыратымдылықтағы массалық спектрометрия (иондық микроскопия), ол жасушаішілік антибиотиктердің орналасуы туралы коррелятивті ақпарат беру үшін қолданылды, мұндай деректерді басқа тәсілдермен алу қиын. Электронды микроскоптардың бастапқы рөлі екі өлшемді кесінділерді (TEM) немесе үлгі бетін (SEM екінші электронды) бейнелеуде үлгілердің тереңдігіне қарай кеңейе берді. Бұл «көлемдік ЭМ» жұмыс ағынының алғашқы мысалы – үлгі арқылы кесілген сериялық кесінділердің TEM суреттерін жинақтау. Келесі даму – TEM томографиясы арқылы әртүрлі бұрыштарда түсірілген суреттер жиынтығын кері проекциялау арқылы қалың кесіндінің (200–500 нм) көлемін виртуалды түрде қайта құру.

Ем-көлемді сериялық бейнелеу

ТЭМ томографиясынан (z осьте микрометрлер немесе миллиметрлер) гөрі үлкен тереңдіктегі көлемді ЭМ деректер жиынтықтарын алу үшін үлгінің тереңдігінен алынған суреттер сериясын пайдалануға болады. Мысалы, сериялық кесінділердің жолақтары жоғарыда сипатталғандай ТЭМ-де бейнеленуі мүмкін, ал қалың кесінділер қолданылғанда z ажыратымдылығын арттыру үшін сериялық ТЭМ томографиясын қолдануға болады. Соңғы кезде кремний пластиналарында жиналған үлкен кесінділер сериясынан кері шашыраған электрондардың (BSE) суреттерін алуға болады, бұл SEM матрицалық томография деп аталады. Баламалы тәсіл – әр кесінді алынып тасталғаннан кейін кесіндінің орнына блок бетін бейнелеу үшін BSE SEM қолдану. Осы әдіспен СЭМ камерасына орнатылған ультрамикротом жұмыс процесін автоматтандыруды арттыра алады; үлгі блогы камераға жүктеледі және жүйе үлгі арқылы үздіксіз кесіп, бейнелеу үшін бағдарламаланады. Бұл сериялық блок бетінің СЭМ ретінде белгілі. Сыртымен кесу үшін ультрамикротомның орнына шоғырланған иондық сәулемен кесу әдісі қолданылады. Бұл сериялық бейнелеу әдістеріндегі нәтиже – үлгі блогы арқылы алынған суреттердің тізбегі, оны цифрлық түрде реттеп, осылайша көлемді ЭМ деректер жиынтығына қайта құруға болады. Бұл әдістерде қол жетімді көлемнің артуы электронды микроскопияның жаңа сұрақтарды шешу мүмкіндігін, сондай-ақ органельдер арасындағы мембраналық байланыс орындарын зерттеуге мүмкіндік берді.

Кемшіліктер

Электрондық микроскоптарды жасау және күтіп ұстау қымбатқа түседі. Жоғары ажыратымдылыққа қол жеткізуге арналған микроскоптар тұрақты ғимараттарда (кейде жер астында) орналастырылуы керек, олар магнит өрісін жоятын жүйелер сияқты арнайы жабдықтармен қамтамасыз етілуі тиіс. Көп жағдайда үлгілер вакуумде қарастырылуы қажет, себебі ауа құрамындағы молекулалар электрондарды шашыратады. Бірақ, сұйық фазалық электрондық микроскопия – жабық сұйық жасуша немесе қоршаған орта камерасын қолдану арқылы, мысалы, қоршаған ортаны сканерлейтін электрондық микроскопта, гидратацияланған үлгілерді төмен қысымда (± 1 °C) ылғалды ортада қарауға мүмкіндік береді. Газ тәрізді үлгілерді *in situ* электрондық микроскопиясы үшін әртүрлі әдістер әзірленген. Дәстүрлі жоғары вакуум режимінде жұмыс істейтін сканерлік электрондық микроскоптар көбінесе өткізгіш үлгілерді бейнелейді; сондықтан өткізгіш емес материалдарға өткізгіш жабын (алтын/палладий қорытпасы, көміртек, осмий және т.б.) қажет. Заманауи микроскоптардың төмен вольтты режимде жұмыс істеуі өткізгіш емес үлгілерді жабынсыз қарауға мүмкіндік береді. Өткізгіш емес материалдарды өзгермелі қысымды (немесе қоршаған ортаны) сканерлік электрондық микроскоп арқылы да бейнелеуге болады. Көміртек нанотүтікшелер, диатомдық қабықшалар және кішкентай минералды кристалдар (мысалы, асбест талшықтары) сияқты кішкентай, тұрақты үлгілерді электрондық микроскопта қарау үшін арнайы өңдеудің қажеті жоқ. Гидратацияланған материалдардың, соның ішінде барлық биологиялық үлгілердің үлгілерін тұрақтандыру, қалыңдығын азайту (ультражұқа кесу) және олардың электрондық оптикалық контрастын арттыру (бояу) үшін әртүрлі әдістермен дайындау қажет. Бұл процестер артефактілердің пайда болуына әкелуі мүмкін, бірақ оларды әдетте әртүрлі үлгі дайындау әдістерін қолданып алынған нәтижелерді салыстыру арқылы анықтауға болады. 1980 жылдардан бері криофиксацияланған, шыныланған үлгілерді талдау ғалымдар тарапынан кеңінен қолданылып келеді, бұл осы техниканың дұрыстығын одан әрі растайды.