Жалқы молекулалық күш спектроскопиясы: әдістер мен қолданылуы
Force spectroscopy
Молекулалық күш спектроскопиясы – жеке молекулалар арасындағы байланыз күшін зерттейтін әдіс. Полимерлер, ақуыздар мен химиялық байланыстардың қасиеттерін өлшейді.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Күш спектроскопиясы – жеке молекулалар арасындағы өзара әрекеттесулер мен байланысу күштерін зерттеуге арналған әдістер жиынтығы. Бұл әдістерді жеке полимер молекулаларының немесе ақуыздардың, немесе жеке химиялық байланыстардың механикалық қасиеттерін өлшеу үшін пайдалануға болады. "Күш спектроскопиясы" атауы ғылыми қауымдастықта кеңінен қолданылса да, шатастыратын, себебі нақты материя сәулеленуімен өзара әрекеттесу болмайды. Күш спектроскопиясын жүзеге асыруға болатын әдістерге атомдық күш микроскопиясы, магниттік қысқыштар, акустикалық күш спектроскопиясы, микроинелер және биомембраналар жатады. Күш спектроскопиясы молекуланың созылу немесе бұрылу механикалық күшіне реакциясын өлшейді. Осылайша, соңғы жылдары бұлшықет жиырылуы, жасуша ішіндегі тасымалдау, энергия өндіру (F1 АТФаза), ДНК көшіру және транскрипция (полимеразалар), ДНК түйінін шешу және айналдыру (топоизомеразалар және геликазалар) үшін жауапты ферменттердегі механохимиялық байланыс туралы көп мәліметтер алынды. Типикалық ансамбльдік спектроскопиядан өзгеше, бұл әдіс зерттеушіге зерттеліп жатқан нақты молекуланың қасиеттерін анықтауға мүмкіндік береді. Атап айтқанда, ансамбльде көрінбейтін конформациялық өзгерістер сияқты сирек оқиғаларды байқауға болады.
Force spectroscopy is a set of techniques for the study of the interactions and the binding forces between individual molecules. These methods can be used to measure the mechanical properties of single polymer molecules or proteins, or individual chemical bonds. The name "force spectroscopy", although widely used in the scientific community, is somewhat misleading, because there is no true matter radiation interaction. Techniques that can be used to perform force spectroscopy include atomic force microscopy, magnetic tweezers, acoustic force spectroscopy, microneedles, and biomembranes. Force spectroscopy measures the behavior of a molecule under stretching or torsional mechanical force. In this way a great deal has been learned in recent years about the mechanochemical coupling in the enzymes responsible for muscle contraction, transport in the cell, energy generation (F1 ATPase), DNA replication and transcription (polymerases), DNA unknotting and unwinding (topoisomerases and helicases). As a single molecule technique, as opposed to typical ensemble spectroscopies, it allows a researcher to determine properties of the particular molecule under study. In particular, rare events such as conformational change, which are masked in an ensemble, may be observed.
Эксперименттік әдістер
Молекулаларды дәл манипуляциялаудың көптеген тәсілдері бар. Олардың ішінде оптикалық немесе магниттік пинцеттер, атомдық күш микроскопы (АҚМ) консольдары және акустикалық күш спектроскопиясы ерекше көзге түседі. Осы техникалардың барлығында, ақуыз немесе ДНҚ сияқты биомолекуланың немесе басқа биополимердің бір ұшы бетке немесе микрометрлік өлшемдегі дөңгелекке, ал екінші ұшы күш сенсорына бекітіледі. Күш сенсоры әдетте микрометрлік өлшемдегі дөңгелек немесе консоль болып табылады, оның орын ауысуын өлшеу арқылы күш анықталады.
There are many ways to accurately manipulate single molecules. Prominent among these are optical or magnetic tweezers, atomic force microscope (AFM) cantilevers and acoustic force spectroscopy. In all of these techniques, a biomolecule, such as protein or DNA, or some other biopolymer has one end bound to a surface or micrometre sized bead and the other to a force sensor. The force sensor is usually a micrometre sized bead or a cantilever, whose displacement can be measured to determine the force.
Акустикалық күш спектроскопиясы
Жақында әзірленген акустикалық күш спектроскопиясы (АФС) әдісі жүздеген жеке молекулалар мен жасушаларды параллель түрде күшпен манипуляциялауға мүмкіндік береді, осы арқылы жоғары тәжірибелік өнімділік қамтамасыз етіледі. Вирустық белоктарды да АФС арқылы зерттеуге болады, мысалы, бұл техника ДНК-ның жиырылуын, басқа да жеке молекулалық тәсілдермен бірге зерттеу үшін қолданылған. Жасушаларды акустикалық күштермен тікелей немесе микросфераларды тұтқа ретінде пайдаланып манипуляциялауға болады.
A recently developed technique, acoustic force spectroscopy (AFS), allows the force manipulation of hundreds of single molecules and single cells in parallel, providing high experimental throughput. Viral proteins also can be studied by AFS, for instance this technique was used to explore DNA compaction along with other single molecule approaches. Cells also can be manipulated by the acoustic forces directly, or by using microspheres as handles.
Оптикалық пинцеттер
Молекулалық эксперименттер үшін тағы бір кеңінен қолданыла бастаған әдіс – молекулаларға механикалық күш түсіру үшін оптикалық пинцеттерді пайдалану. Күшті шоғырланған лазерлік сәуле диэлектрлік материалдан жасалған бөлшектерді нанометрден микрометрге дейінгі өлшемдер аралығында ұстап, бекіте алады. Оптикалық пинцеттердің ұстау әрекеті диэлектрлік сфераға түсетін дипольдік немесе оптикалық градиент күшінен туындайды. Фокусланған лазерлік сәулені атомдық тұзақ ретінде қолдану әдісі алғаш рет 1984 жылы Белл зертханаларында қолданылған. Оған дейін бөлшектерді тұтқындау үшін қарама-қарсы бағытталған лазерлерді пайдалану арқылы тәжірибелер жүргізілді. Кейінірек Белл зертханаларындағы сол жоба аясында және басқа да зертханаларда инфрақызыл лазерді қолдана отырып, жасушаларды зақымдамай манипуляциялау мүмкіндігі көрсетілді. Осылайша, оптикалық тұзақтау арқылы биологиялық эксперименттер жүргізуге негіз қаланды. Әр әдістің өз артықшылықтары мен кемшіліктері бар. Мысалы, АФМ кантилеверлері ангстремдік масштабтағы, миллисекундтық оқиғаларды және 10 пН-нан асатын күштерді өлшеуге мүмкіндік береді. Ал шыны микроталшықтары осындай кеңістіктік және уақыттық ажыратымдылыққа қол жеткізе алмайды, бірақ пиконевтондық күштерді өлшеуге қабілетті. Оптикалық пинцеттер пиконевтондық күштерді және нанометрлік орын ауыстыруларды өлшеуге мүмкіндік береді, бұл көптеген биологиялық эксперименттер үшін өте қолайлы диапазон. Магниттік пинцеттер фемтоньютондық күштерді өлшеуге болады, сонымен қатар бұрылу күшін де қолдануға болады. AFS құрылғылары биологиялық жүйелердің механикалық қасиеттерін статистикалық талдауға мүмкіндік береді, олар үшін жүздеген жеке бөлшектерге параллель түрде пиконьютондық күштер түсіріледі, ал жауап беру уақыты миллисекундтан кем болады.
Another technique that has been gaining ground for single molecule experiments is the use of optical tweezers for applying mechanical forces on molecules. A strongly focused laser beam has the ability to catch and hold particles (of dielectric material) in a size range from nanometers to micrometers. The trapping action of optical tweezers results from the dipole or optical gradient force on the dielectric sphere. The technique of using a focused laser beam as an atom trap was first applied in 1984 at Bell laboratories. Until then experiments had been carried out using oppositely directed lasers as a means to trap particles. Later experiments, at the same project at Bell laboratories and others since, showed damage free manipulation on cells using an infrared laser. Thus, the ground was made for biological experiments with optical trapping. Each technique has its own advantages and disadvantages. For example, AFM cantilevers, can measure angstrom scale, millisecond events and forces larger than 10 pN. While glass microfibers cannot achieve such fine spatial and temporal resolution, they can measure piconewton forces. Optical tweezers allow the measurement of piconewton forces and nanometer displacements which is an ideal range for many biological experiments. Magnetic tweezers can measure femtonewton forces, and additionally they can also be used to apply torsion. AFS devices allow the statistical analysis of the mechanical properties of biological systems by applying picoNewton forces to hundreds of individual particles in parallel, with sub millisecond response time.
Қолданбалар
Күш спектроскопиясының кең таралған қолданылуларының бірі – полимерлердің серпімділігін өлшеу, әсіресе РНҚ және ДНҚ сияқты биополимерлерді. Полимерлік күш спектроскопиясының тағы бір биофизикалық қолданылуы – ақуыздың жазылуы. Модульді ақуыздар алтын немесе (сирек жағдайларда) мика бетіне адсорбцияланып, содан кейін созылуы мүмкін. Модульдердің тікелей жазылуы күш пен ұзарту графигінде өте ерекше, арақашықтығы бар тістің пішінімен көрінеді; әрбір тіс бір ақуыз модулінің жазылуына сәйкес келеді (соңғы тіс әдетте ақуыз молекуласының ұшынан ажырауынан болады). Осы әдіс арқылы ақуыздың серпімділігі және жазылуы туралы көптеген мәліметтер алуға болады. Тірі жасушадағы көптеген ақуыздар механикалық кернеуге төтеп беруі керек. Сонымен қатар, күш спектроскопиясы ДНҚ репликациясы, транскрипциясы, ұйымдастырылуы және жөнделуіне қатысатын ақуыздардың ферменттік белсенділігін зерттеу үшін қолданылуы мүмкін. Бұл, бір шеті бетке бекітілген ДНҚ тізбегіне тоқтатылған ДНҚ-ақуыз кешеніне бекітілген шариктың орнын, күшті тұрақты ұстап өлшеу арқылы жүзеге асырылады. Мысалы, бұл әдіс клепсидин мен ацинетодиннің транскрипцияның ұзаруын тежеуін зерттеу үшін қолданылды. Күш спектроскопиясының тағы бір маңызды қолданылуы – химиялық байланыстардың механикалық кедергісін зерттеу. Бұл жағдайда, ұшы әдетте беттегі басқа молекуламен байланысатын лигандпен функционалданады. Ұшы бетке итеріліп, екі молекуланың арасында контактіге мүмкіндік жасалады, содан кейін жаңадан пайда болған байланыс үзілгенше кері тартылады. Байланыстың үзілу күші өлшенеді. Механикалық үзілу кинетикалық, стохастикалық процесс болғандықтан, үзілу күші абсолютті параметр емес, ол температура мен тартылу жылдамдығының функциясы болып табылады. Төмен температура және жоғары тартылу жылдамдығы жоғары үзілу күштеріне сәйкес келеді. Әртүрлі тартылу жылдамдықтарындағы үзілу күшін мұқият талдау арқылы механикалық күш астындағы химиялық байланыстың энергиялық ландшафтын дамытуға болады. Бұл антидене-антиген, ақуыз-ақуыз, ақуыз-тірі жасуша өзара әрекеттесуін және тұтқын байланыстарын зерттеуде қызықты нәтижелерге әкеліп отыр. Жақында бұл әдіс жасуша биологиясында цитоплазмадағы бөлшектердің қозғалысына әсер ететін моторлы ақуыздар тудырған агрегациялық стохастикалық күштерді өлшеу үшін қолданылды. Осылайша, күш спектрлі микроскопиясы цитоплазмадағы бөлшектердің қозғалысын қажет ететін көптеген жасушалық процестерді жақсырақ түсінуге көмектеседі.
Common applications of force spectroscopy are measurements of polymer elasticity, especially biopolymers such as RNA and DNA. Another biophysical application of polymer force spectroscopy is on protein unfolding. Modular proteins can be adsorbed to a gold or (more rarely) mica surface and then stretched. The sequential unfolding of modules is observed as a very characteristic sawtooth pattern of the force vs elongation graph; every tooth corresponds to the unfolding of a single protein module (apart from the last that is generally the detachment of the protein molecule from the tip). Much information about protein elasticity and protein unfolding can be obtained by this technique. Many proteins in the living cell must face mechanical stress. Moreover, force spectroscopy can be used to investigate the enzymatic activity of proteins involved in DNA replication, transcription, organization and repair. This is achieved by measuring the position of a bead attached to a DNA protein complex stalled on a DNA tether that has one end attached to a surface, while keeping the force constant. This technique has been used, for example, to study transcription elongation inhibition by Klebsidin and Acinetodin. The other main application of force spectroscopy is the study of mechanical resistance of chemical bonds. In this case, generally the tip is functionalized with a ligand that binds to another molecule bound to the surface. The tip is pushed on the surface, allowing for contact between the two molecules, and then retracted until the newly formed bond breaks up. The force at which the bond breaks up is measured. Since mechanical breaking is a kinetic, stochastic process, the breaking force is not an absolute parameter, but it is a function of both temperature and pulling speed. Low temperatures and high pulling speeds correspond to higher breaking forces. By careful analysis of the breaking force at various pulling speeds, it is possible to map the energy landscape of the chemical bond under mechanical force. This is leading to interesting results in the study of antibody antigen, protein protein, protein living cell interaction and catch bonds. Recently this technique has been used in cell biology to measure the aggregative stochastic forces created by motor proteins that influence the motion of particles within the cytoplasm. In this way, force spectrum microscopy may be used better to understand the many cellular processes that require the motion of particles within cytoplasm.