Введение

Тип микроскопа, использующий электроны в качестве источника освещения.

Электронный микроскоп – это микроскоп, использующий пучок электронов в качестве источника освещения. Он использует электронную оптику, аналогичную стеклянным линзам оптического светового микроскопа, для управления электронным пучком, например, для фокусировки с целью получения увеличенных изображений или дифракционных картин. Поскольку длина волны электрона может быть до 100 000 раз меньше длины волны видимого света, электронные микроскопы обладают значительно более высоким разрешением – около 0,1 нм, в то время как разрешение световых микроскопов составляет около 200 нм. Электронный микроскоп может включать в себя: трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ), при которой быстрые электроны проходят через тонкий образец; сканирующую трансмиссионную электронную микроскопию (STEM), которая аналогична ТЭМ, но использует сканирующий электронный зонд; сканирующий электронный микроскоп (SEM), который похож на STEM, но предназначен для работы с толстыми образцами; электронный микрозонд, аналогичный SEM, но в большей степени предназначенный для химического анализа; ультрабыструю сканирующую электронную микроскопию – версию SEM, способную работать с высокой скоростью; низкоэнергетическую электронную микроскопию (LEEM), используемую для визуализации поверхностей; фотоэмиссионную электронную микроскопию (PEEM), которая аналогична LEEM и использует электроны, испускаемые с поверхностей под действием фотонов. Дополнительную информацию можно найти по указанным ссылкам. В данной статье содержится общая информация, преимущественно о трансмиссионных электронных микроскопах.

История

Многие разработки заложили основу электронной оптики, используемой в микроскопах. Одним из значительных шагов стала работа Герца в 1883 году, который создал катодную трубку с электростатическим и магнитным отклонением, продемонстрировав возможность управления направлением электронного луча. Другими важными достижениями были фокусировка электронов осевым магнитным полем, осуществлённая Эмилем Вихертом в 1899 году, усовершенствованные оксидные катоды, обеспечивающие большую эмиссию электронов (Артур Веэнльт, 1905 год), и разработка электромагнитной линзы Хансом Бушем в 1926 году. По словам Денниса Габора, физик Лео Силард в 1928 году пытался убедить его построить электронный микроскоп, патент на который Силард уже подал. Вопрос о том, кто изобрел электронный микроскоп, остаётся дискуссионным и по сей день. В 1928 году в Техническом университете Берлина Адольф Маттиас (профессор высоковольтной техники и электроустановок) назначил Макса Кнолла руководителем группы исследователей для развития исследований электронных лучей и электронно-лучевых осциллографов. В команду входили несколько аспирантов, в том числе Эрнст Руска. В 1931 году Максу Кноллю и Эрнсту Руске удалось получить увеличенные изображения сетчатых структур, помещённых над анодным отверстием. Устройство, реплика которого показана на рисунке, использовало две магнитные линзы для достижения большего увеличения и стало первым электронным микроскопом. (Макс Кнолль умер в 1969 году и не получил долю Нобелевской премии 1986 года за изобретение электронных микроскопов.) Параллельно, независимо от этих работ, велась разработка в компании Siemens Schuckert под руководством Рейнхольда Рюденберга. Согласно патентному законодательству (U.S. Patent No. 2058914 и 2070318, оба заявлены в 1932 году), он является изобретателем электронного микроскопа, однако неясно, когда у него появился рабочий прототип. В краткой статье, опубликованной в 1932 году, он утверждал, что Siemens занимался этой работой в течение нескольких лет до подачи патентов в 1932 году, подчеркивая, что его усилия шли параллельно университетским исследованиям. Он умер в 1961 году и, подобно Максу Кноллю, не имел права на долю Нобелевской премии 1986 года. В следующем, 1933 году, Руска и Кнолль построили первый электронный микроскоп, превзошедший по разрешающей способности оптический (световой) микроскоп. Четыре года спустя, в 1937 году, Siemens финансировал работу Эрнста Руски и Бодо фон Борриса, а также нанял Гельмута Руску, брата Эрнста, для разработки областей применения микроскопа, особенно в биологии. Также в 1937 году Манфред фон Арденне стал пионером в разработке сканирующего электронного микроскопа. В 1938 году Siemens выпустил первый коммерческий электронный микроскоп. Первые североамериканские электронные микроскопы были созданы в 1930-х годах в Университете штата Вашингтон Андерсоном и Фицсиммонсом, а также в Университете Торонто Эли Франклином Бертоном и его студентами Сесилом Холлом, Джеймсом Хилльером и Альбертом Пребусом. В 1939 году Siemens выпустил электронный микроскоп передачи (ЭМП). Хотя современные электронные микроскопы способны достигать увеличения в два миллиона раз, как научные инструменты они остаются в основном похожими, но с улучшенной оптикой.

Трансмиссионный электронный микроскоп (TEM)

Первоначальная форма электронного микроскопа, просвечивающий электронный микроскоп (TEM), использует высоковольтный электронный луч для освещения образца и создания изображения. Электронный луч генерируется электронным источником, при этом электроны обычно имеют энергию от 40 до 400 кэВ, фокусируются электромагнитными линзами и проходят через образец. При выходе из образца электронный луч несет информацию о его структуре, которая увеличивается линзами микроскопа. Пространственное распределение этой информации ("изображение") можно визуализировать, проецируя увеличенное электронное изображение на детектор. Например, изображение может быть непосредственно просмотрено оператором на флуоресцентном экране, покрытом люминофором или сцинтиллятором, таким как сульфид цинка. Люминофор с высоким разрешением также может быть соединен посредством оптической системы линз или световода с сенсором цифровой камеры. Прямые электронные детекторы не содержат сцинтиллятора и непосредственно подвергаются воздействию электронного луча, что позволяет преодолеть некоторые ограничения камер, использующих сцинтилляторы. Разрешение просвечивающих электронных микроскопов в основном ограничено сферической аберрацией, однако новое поколение аппаратных корректоров позволяет уменьшить сферическую аберрацию и повысить разрешение в высокоразрешающей просвечивающей электронной микроскопии (HRTEM) до менее 0,5 ангстрема (50 пикометров), обеспечивая увеличение более чем в 50 миллионов раз. Возможность HRTEM определять положение атомов в материалах полезна для исследований и разработок в области нанотехнологий. Просвечивающие электронные микроскопы часто используются в режиме электронной дифракции. Преимущества электронной дифракции перед рентгеновской кристаллографией заключаются в том, что образец не обязательно должен быть монокристаллом или даже поликристаллическим порошком.

Сканирующий электронный микроскоп (STEM)

STEM сканирует сфокусированный зонд пучка по образцу. Высокое разрешение, достигаемое в TEM, таким образом, возможно и в STEM. Фокусировка (и аберрации) происходит до попадания электронов на образец в STEM, но после – в TEM. Использование в STEM растровой системы, подобной SEM, упрощает съемку изображений в режиме кольцевого темного поля и другие аналитические методы, но также означает, что данные изображения собираются последовательно, а не параллельно.

Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ)

СЭМ формирует изображения, сканируя образец сфокусированным электронным лучом, который перемещается по поверхности образца (растровое сканирование). При взаимодействии электронного луча с образцом он теряет энергию различными способами. Эта потерянная энергия преобразуется в другие формы, такие как тепло, эмиссия низкоэнергетических вторичных электронов и высокоэнергетических отражённых электронов, свечение (катодолюминесценция) или рентгеновское излучение – все они генерируют сигналы, содержащие информацию о свойствах поверхности образца, включая его топографию и состав. Изображение, отображаемое СЭМ, представляет собой карту изменения интенсивности любого из этих сигналов, соответствующую положению луча на образце в момент генерации сигнала. На изображении муравья изображение было построено на основе сигналов, полученных вторичным электронным детектором, что является стандартным режимом визуализации в большинстве СЭМ. Обычно разрешение изображения СЭМ ниже, чем у ПЭМ. Однако, поскольку СЭМ визуализирует поверхность образца, а не его внутреннюю структуру, электронам не требуется проникать сквозь образец. Это снижает необходимость в сложной подготовке образца для достижения электронной прозрачности. СЭМ также обладает большой глубиной резкости, что позволяет получать изображения, хорошо отражающие трёхмерную форму поверхности образца. В наиболее распространенных конфигурациях электронные микроскопы создают изображения с одним значением яркости для каждого пикселя, результаты обычно отображаются в оттенках серого. Однако часто эти изображения затем раскрашиваются с помощью программного обеспечения для выделения признаков или вручную с использованием графического редактора. Это может быть сделано для улучшения визуализации структуры или в эстетических целях и, как правило, не добавляет новой информации об образце.

Подготовка образцов для TEM

Материалы, предназначенные для исследования в просвечивающем электронном микроскопе, могут потребовать предварительной обработки для получения подходящего образца. Необходимая техника варьируется в зависимости от исследуемого образца и требуемого анализа: химическая фиксация – для биологических образцов она направлена на стабилизацию подвижной макромолекулярной структуры образца посредством химического сшивания белков альдегидами, такими как формальдегид и глутаральдегид, и липидов тетроксидом осмия. Криофиксация – замораживание образца таким образом, чтобы вода образовывала стекловидный (некристаллический) лёд. Это позволяет сохранить образец в состоянии, максимально приближенном к его естественному. Методы достижения витрификации включают быстрое замораживание в жидком этане и замораживание под высоким давлением. От этой техники развилось целое направление – криоэлектронная микроскопия. С развитием криоэлектронной микроскопии витрифицированных срезов (CEMOVIS) и криофокусированной ионно-лучевой фрезеровки ламеллей стало возможным наблюдать образцы практически любого биологического материала в состоянии, близком к его естественному. Обезвоживание – замена воды органическими растворителями, такими как этанол или ацетон, с последующей сушкой в критической точке или инфильтрацией внедряющими смолами. См. также лиофилизация. Внедрение (для биологических образцов) – после обезвоживания ткань для наблюдения в просвечивающем электронном микроскопе внедряется, чтобы её можно было нарезать для последующего исследования. Для этого ткань последовательно обрабатывают «переходным растворителем», таким как оксид пропилена (эпоксипропан) или ацетон, а затем пропитывают эпоксидной смолой, например, аральдитом, эпоном или дюркупаном; ткани также могут быть непосредственно внедрены в водорастворимую акриловую смолу. После полимеризации (отверждения) смолы образец нарезают ультрамикротомом и окрашивают. Внедрение (для материалов) – после внедрения в смолу образец обычно шлифуют и полируют до зеркального блеска с использованием ультратонких абразивов. Разрывное переломление или травление замораживанием – метод подготовки, особенно полезный для изучения липидных мембран и включенных в них белков в виде «лицевой» поверхности. Свежую ткань или клеточную суспензию быстро замораживают (криофиксация), затем осуществляют перелом (разрыв) или используют микротом. Существуют также связанные методы, которые маркируют поверхность вытравленных клеток и другие варианты репликационной маркировки. Ионно-лучевая фрезеровка – утоньшает образцы до прозрачности для электронов путем бомбардировки поверхности ионами (обычно аргоном) под углом и распыления материала с поверхности. Подразделом этого метода является фокусированная ионно-лучевая фрезеровка, при которой ионы галлия используются для получения электронно-прозрачной мембраны или «ламеллы» в определенной области образца, например, в устройстве внутри микропроцессора или при фокусированной ионно-лучевой сканирующей электронной микроскопии (SEM). Ионно-лучевая фрезеровка также может использоваться для полировки поперечных сечений перед анализом материалов, которые трудно подготовить механической полировкой. Негативное окрашивание – суспензии, содержащие наночастицы или мелкий биологический материал (например, вирусы и бактерии), кратковременно смешивают с разбавленным раствором непрозрачного для электронов вещества, такого как молибдат аммония, ацетат уранила (или формат) или фосфовольфрамовая кислота. Эта смесь наносится на носитель для образцов (сетку), предварительно покрытый пластиковой пленкой, например, формваром, затем удаляется избыток жидкости и образец высушивается. Для получения наилучших результатов просмотр препарата в просвечивающем электронном микроскопе следует проводить без задержки. Метод важен в микробиологии для быстрой, хотя и грубой, морфологической идентификации, но также может использоваться в качестве основы для высокоточного трехмерного восстановления с использованием томографической электронной микроскопии при использовании углеродных пленок в качестве носителя. Негативное окрашивание также используется для наблюдения наночастиц. Нарезание срезов – получение тонких срезов образца, полупрозрачных для электронов. Их можно нарезать ультрамикротомом с использованием стеклянного или алмазного ножа для получения ультратонких срезов толщиной около 60–90 нм. Также используются одноразовые стеклянные ножи, поскольку их можно изготовить в лаборатории, и они значительно дешевле. Срезы также могут быть созданы непосредственно в SEM с фокусированным ионным лучом, где такой срез называется ламеллью.

ЭМ рабочие процессы

Ранняя электронная микроскопия биологических образцов часто носила описательный характер, используя вновь доступное более высокое разрешение. Это по-прежнему справедливо для различных применений, таких как диагностическая электронная микроскопия. Однако электронные микроскопы в настоящее время часто используются в более сложных рабочих процессах, причём каждый рабочий процесс обычно включает несколько технологий для проведения более сложных и/или количественных анализов образца. Ниже приведены несколько примеров, но этот список не следует считать исчерпывающим. Выбор рабочего процесса будет в значительной степени зависеть от области применения и требований соответствующих научных задач, таких как разрешение, объем, природа целевой молекулы и т.д. Например, изображения, полученные с помощью световой и электронной микроскопии одной и той же области образца, могут быть наложены для сопоставления данных, полученных двумя методами. Это обычно используется для получения контекстной ЭМ-информации с более высоким разрешением о флуоресцентно меченной структуре. Эта коррелятивная свето-электронная микроскопия (CLEM) является одним из ряда доступных коррелятивных рабочих процессов. Другой пример – масс-спектрометрия высокого разрешения (ионная микроскопия), которая использовалась для получения коррелятивной информации о субклеточной локализации антибиотиков, данные, которые было бы трудно получить другими способами. Первоначальная роль электронных микроскопов в визуализации двумерных срезов (TEM) или поверхности образца (SEM с вторичными электронами) также всё чаще расширяется вглубь образцов. Ранним примером таких «объёмных ЭМ» рабочих процессов было простое наложение изображений TEM последовательных срезов, полученных через образец. Следующим этапом стала виртуальная реконструкция объёма толстого среза (200–500 нм) путём обратной проекции набора изображений, полученных под разными углами наклона – TEM-томография.

Серийная визуализация для объема ЭМ

Для получения объемных ЭМ-наборов данных с большей глубиной, чем при TEM-томографии (микрометры или миллиметры по оси z), можно использовать серию изображений, полученных при прохождении через образец. Например, ленты последовательных срезов могут быть визуализированы в TEM, как описано выше, а при использовании более толстых срезов последовательная TEM-томография может быть использована для повышения разрешения по оси z. В последнее время изображения обратно рассеянных электронов (BSE) получают из большей серии срезов, собранных на кремниевых пластинах, что известно как SEM-томография массивов. Альтернативный подход заключается в использовании BSE SEM для визуализации поверхности блока вместо среза после удаления каждого среза. При этом ультрамикротом, установленный в камере SEM, может повысить автоматизацию рабочего процесса: блок образца загружается в камеру, а система программируется для непрерывного срезания и визуализации образца. Это называется серийным блочным SEM. Связанный метод использует фрезерование сфокусированным ионным пучком вместо ультрамикротома для удаления срезов. В этих методах серийной визуализации результатом является, по сути, последовательность изображений через блок образца, которую можно цифровым образом выровнять последовательно и, таким образом, реконструировать в объемный ЭМ-набор данных. Увеличенный объем, доступный при использовании этих методов, расширил возможности электронной микроскопии для решения новых задач, таких как изучение мембранных контактных сайтов между органеллами.

Недостатки

Электронные микроскопы дороги в изготовлении и обслуживании. Микроскопы, предназначенные для достижения высокого разрешения, должны размещаться в стабильных зданиях (иногда подземных) со специальным оборудованием, таким как системы компенсации магнитного поля. В основном образцы необходимо рассматривать в вакууме, поскольку молекулы, составляющие воздух, рассеивают электроны. Исключением является жидкофазная электронная микроскопия, использующая закрытую жидкую ячейку или камеру окружающей среды, например, в сканирующем электронном микроскопе с регулируемой средой, который позволяет наблюдать гидратированные образцы во влажной среде при низком давлении (до 2 мм рт. ст.). Разработаны различные методы электронной микроскопии газообразных образцов *in situ*. Сканирующие электронные микроскопы, работающие в обычном режиме высокого вакуума, обычно визуализируют проводящие образцы; поэтому непроводящие материалы требуют нанесения проводящего покрытия (сплав золота и палладия, углерод, осмий и т. д.). Режим низкого напряжения современных микроскопов позволяет наблюдать непроводящие образцы без покрытия. Непроводящие материалы также могут быть визуализированы с помощью сканирующего электронного микроскопа с переменным давлением (или с регулируемой средой). Небольшие, стабильные образцы, такие как углеродные нанотрубки, панцири диатомовых водорослей и мелкие минеральные кристаллы (например, асбестовые волокна), не требуют специальной обработки перед исследованием в электронном микроскопе. Образцы гидратированных материалов, включая почти все биологические образцы, должны быть подготовлены различными способами для их стабилизации, уменьшения толщины (ультратонкое сечение) и повышения электронно-оптического контраста (окрашивание). Эти процессы могут приводить к образованию артефактов, но их обычно можно идентифицировать путем сравнения результатов, полученных с использованием принципиально различных методов подготовки образцов. С 1980-х годов анализ криофиксированных и стекловидных образцов также все чаще используется учеными, что дополнительно подтверждает достоверность этой методики.