Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Циклдік зонд технологиясы (CPT) – нақты ДНК тізбектерін анықтауға арналған молекулалық биологиялық техника. CPT изотермиялық жағдайларда жұмыс істейді. Кейбір жағдайларда CPT ПТР-ға балама болып табылады. Дегенмен, ПТР-ден өзгеше, CPT мақсатты ДНК-ның бірнеше көшірмесін жасамайды, сигналдың күшеюі сызықтық, ал ПТР-де мақсатты ДНК-ның экспоненциалды күшеюіне қарамастан. CPT реттілікке тән химерлік зондты пайдаланады, ол толықтыратын мақсатты ДНК тізбегімен гибридтеледі және RNase H үшін субстратқа айналады. РНК-ның ішкі нуклеотидтік байланыстарында кесу жүреді, нәтижесінде зонд мақсаттан ажыратылады, соның арқасында келесі зонд молекуласы үшін қолжетімді болады. CPT-де пайдалану үшін интеграцияланған электрокинетикалық жүйелер жасалған.
Cycling probe technology (CPT) is a molecular biological technique for detecting specific DNA sequences. CPT operates under isothermal conditions. In some applications, CPT offers an alternative to PCR. However, unlike PCR, CPT does not generate multiple copies of the target DNA itself, and the amplification of the signal is linear, in contrast to the exponential amplification of the target DNA in PCR. CPT uses a sequence specific chimeric probe which hybridizes to a complementary target DNA sequence and becomes a substrate for RNase H. Cleavage occurs at the RNA internucleotide linkages and results in dissociation of the probe from the target, thereby making it available for the next probe molecule. Integrated electrokinetic systems have been developed for use in CPT.
Зонд
Циклдік зонд технологиясы белгілі бір ДНК тізбегінің болуын анықтау үшін химерлік нуклеин қышқылы зондын пайдаланады. Химерлік зонд екі ДНК сегментінің арасына орналасқан РНК сегментінен тұрады. РНҚ сегменті 4 қатарынан келетін пурин нуклеотидтерін қамтиды. Зондтардың ұзындығы 30 нуклеотидтен кем болуы керек және зонд ішіндегі және зондтар арасындағы өзара әрекеттесуді азайту үшін жасалуы тиіс.
Cycling probe technology makes use of a chimeric nucleic acid probe to detect the presence of a particular DNA sequence. The chimeric probe consists of an RNA segment sandwiched between two DNA segments. The RNA segment contains 4 contiguous purine nucleotides. The probes should be less than 30 nucleotides in length and designed to minimize intra probe and inter probe interactions.
Процесс
Циклдік зонд технологиясы циклдік, изотермиялық процесті пайдаланады, ол химерлік зондтың мақсатты ДНК-мен гибридтелуінен басталады. Гибридтелгеннен кейін зонд RNase H үшін қолайлы субстратқа айналады. RNase H, эндонуклеаза, зондтың РНК бөлігін кесіп, екі химерлік фрагмент түзеді. Жаңа кесілген фрагменттердің балқу температурасы (Tm) бастапқы зондтың балқу температурасынан төмен. CPT реакциясы бастапқы зондтың балқу температурасынан сәл жоғары изотермиялық түрде сақталады, сондықтан кесілген фрагменттер мақсатты ДНК-дан ажыратылады. Ажыратылғаннан кейін, мақсатты ДНК жаңа зондпен гибридтелуге мүмкіндік алады, осылайша цикл қайта басталады. Фрагменттер кесіліп, ажыратылғаннан кейін оларды анықтауға болады. Фрагменттерді анықтаудың ең көп қолданылатын әдісі – флуоресценция. Бұл әдісте флуоресцентті маркер зондтың 5’ ұшына, ал өшіргіш (quencher) 3’ ұшына бекітіледі. RNase H зондты кескенде, өшіргіш пен флуоресцентті маркер бөлініп, флуоресцентті маркердің қарқындылығы артады. Кесілген фрагменттерді амплификация (мысалы, ПЦР) немесе басқа химиялық анықтау әдістерін қолдану үшін одан әрі модификациялау арқылы да анықтауға болады. Мақсатты ДНК-ның төмен концентрацияларымен жұмыс істегенде, CPT протоколының ерекшелігі мен тиімділігін арттыру үшін өзгертуге болады. Зондты кесу тиімділігін жақсарту үшін берілген уақытты ұзартудың тиімді екені көрсетілген.
Cycling probe technology utilizes a cyclic, isothermal process that begins with the hybridization of the chimeric probe with the target DNA. Once hybridized, the probe becomes a suitable substrate for RNase H. RNase H, an endonuclease, cleaves the RNA portion of the probe, resulting in two chimeric fragments. The melting temperature (Tm) of the newly cleaved fragments is lower than the melting temperature of original probe. Because the CPT reaction is isothermally kept just above the melting point of the original probe, the cleaved fragments dissociate from the target DNA. Once dissociated, the target DNA is free to hybridize with a new probe, beginning the cycle again. After the fragments have been cleaved and dissociated, they become detectable. A common strategy for detecting the fragments involves fluorescence. With this method, a fluorescent marker is attached to the 5’ end of the probe and a quencher is attached to the 3’ end of the probe. When RNase H cleaves the probe, the quencher and fluorescent marker separate, increasing the intensity of the fluorescent marker. Cleaved fragments can alternatively be detected via amplification (e. g., PCR) or further modification to allow for other chemical means of detection. When working with small concentrations of target DNA, the CPT protocol can be modified to increase specificity and efficiency. Increasing allotted time has been shown to improve probe cleavage efficiency.