Циклическая зондовая технология: принцип и применение в молекулярной биологии.
Cycling probe technology
Циклическое зондирование (CPT) – молекулярно-биологический метод для выявления ДНК. Альтернатива ПЦР, работает изотермически, использует химерные зонды и RNase H.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Циклическая технология зондов (CPT) – это молекулярно-биологический метод для обнаружения специфических последовательностей ДНК. CPT работает в изотермических условиях. В некоторых применениях CPT представляет собой альтернативу ПЦР. Однако, в отличие от ПЦР, CPT не создает множественные копии самой ДНК-мишени, а усиление сигнала является линейным, в отличие от экспоненциального усиления ДНК-мишени в ПЦР. CPT использует специфичный к последовательности химерный зонд, который гибридизуется с комплементарной последовательностью ДНК-мишени и становится субстратом для RNase H. Расщепление происходит по внутринуклеотидным связям РНК и приводит к диссоциации зонда от мишени, тем самым делая его доступным для следующей молекулы зонда. Интегрированные электрокинетические системы были разработаны для использования в CPT.
Cycling probe technology (CPT) is a molecular biological technique for detecting specific DNA sequences. CPT operates under isothermal conditions. In some applications, CPT offers an alternative to PCR. However, unlike PCR, CPT does not generate multiple copies of the target DNA itself, and the amplification of the signal is linear, in contrast to the exponential amplification of the target DNA in PCR. CPT uses a sequence specific chimeric probe which hybridizes to a complementary target DNA sequence and becomes a substrate for RNase H. Cleavage occurs at the RNA internucleotide linkages and results in dissociation of the probe from the target, thereby making it available for the next probe molecule. Integrated electrokinetic systems have been developed for use in CPT.
Зонд
Технология циклического зондирования использует химерный нуклеиновый зонд для обнаружения присутствия определенной последовательности ДНК. Химерный зонд состоит из РНК-фрагмента, заключенного между двумя ДНК-фрагментами. РНК-фрагмент содержит 4 последовательных пуриновых нуклеотида. Зонды должны быть менее 30 нуклеотидов в длину и спроектированы таким образом, чтобы минимизировать внутри- и межмолекулярные взаимодействия.
Cycling probe technology makes use of a chimeric nucleic acid probe to detect the presence of a particular DNA sequence. The chimeric probe consists of an RNA segment sandwiched between two DNA segments. The RNA segment contains 4 contiguous purine nucleotides. The probes should be less than 30 nucleotides in length and designed to minimize intra probe and inter probe interactions.
Процесс
Технология циклического зондирования использует циклический изотермический процесс, который начинается с гибридизации химерного зонда с целевой ДНК. После гибридизации зонд становится подходящим субстратом для RNase H. RNase H, эндонуклеаза, расщепляет РНК-часть зонда, в результате чего образуются два химерных фрагмента. Температура плавления (Tm) вновь образованных фрагментов ниже температуры плавления исходного зонда. Поскольку CPT-реакция поддерживается изотермически чуть выше температуры плавления исходного зонда, расщепленные фрагменты диссоциируют от целевой ДНК. После диссоциации целевая ДНК становится свободной для гибридизации с новым зондом, запуская цикл заново. После расщепления и диссоциации фрагменты становятся обнаруживаемыми. Распространенным способом обнаружения фрагментов является флуоресценция. В этом методе к 5'-концу зонда присоединяется флуоресцентный маркер, а к 3'-концу – тушитель флуоресценции. Когда RNase H расщепляет зонд, тушитель и флуоресцентный маркер разделяются, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Расщепленные фрагменты также могут быть обнаружены с помощью амплификации (например, ПЦР) или дальнейшей модификации для обеспечения других химических методов детекции. При работе с низкими концентрациями целевой ДНК протокол CPT может быть модифицирован для повышения специфичности и эффективности. Увеличение времени реакции показало улучшение эффективности расщепления зондов.
Cycling probe technology utilizes a cyclic, isothermal process that begins with the hybridization of the chimeric probe with the target DNA. Once hybridized, the probe becomes a suitable substrate for RNase H. RNase H, an endonuclease, cleaves the RNA portion of the probe, resulting in two chimeric fragments. The melting temperature (Tm) of the newly cleaved fragments is lower than the melting temperature of original probe. Because the CPT reaction is isothermally kept just above the melting point of the original probe, the cleaved fragments dissociate from the target DNA. Once dissociated, the target DNA is free to hybridize with a new probe, beginning the cycle again. After the fragments have been cleaved and dissociated, they become detectable. A common strategy for detecting the fragments involves fluorescence. With this method, a fluorescent marker is attached to the 5’ end of the probe and a quencher is attached to the 3’ end of the probe. When RNase H cleaves the probe, the quencher and fluorescent marker separate, increasing the intensity of the fluorescent marker. Cleaved fragments can alternatively be detected via amplification (e. g., PCR) or further modification to allow for other chemical means of detection. When working with small concentrations of target DNA, the CPT protocol can be modified to increase specificity and efficiency. Increasing allotted time has been shown to improve probe cleavage efficiency.