Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Рестрикционный анализ – это процедура, используемая в молекулярной биологии для подготовки ДНК к анализу или дальнейшей обработке. Иногда её называют фрагментацией ДНК, хотя этот термин применяется и к другим процедурам. При рестрикционном анализе молекулы ДНК расщепляются в определенных участках рестрикции длиной от 4 до 12 нуклеотидов с помощью рестрикционных ферментов, распознающих эти последовательности. Полученная в результате ДНК часто селективно амплифицируется с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), что делает её более подходящей для аналитических методов, таких как электрофорез в агарозном геле и хроматография. Она используется в генетическом типировании, субклонировании плазмид и RFLP-анализе.
A restriction digest is a procedure used in molecular biology to prepare DNA for analysis or other processing. It is sometimes termed DNA fragmentation, though this term is used for other procedures as well. In a restriction digest, DNA molecules are cleaved at specific restriction sites of 4 12 nucleotides in length by use of restriction enzymes which recognize these sequences. The resulting digested DNA is very often selectively amplified using polymerase chain reaction (PCR), making it more suitable for analytical techniques such as agarose gel electrophoresis, and chromatography. It is used in genetic fingerprinting, plasmid subcloning, and RFLP analysis.
Место ограничения
Данный фермент рестрикции разрезает сегменты ДНК в пределах определенной нуклеотидной последовательности, в так называемом сайте рестрикции. Эти последовательности распознавания обычно имеют длину четыре, шесть, восемь, десять или двенадцать нуклеотидов и, как правило, являются палиндромами (то есть, имеют одинаковую последовательность нуклеотидов в направлениях 5'–3'). Поскольку существует ограниченное количество способов расположить четыре нуклеотида, составляющие ДНК (аденин, тимин, гуанин и цитозин), в последовательность от четырех до двенадцати нуклеотидов, последовательности распознавания, как правило, встречаются случайно в любой длинной последовательности. Ферменты рестрикции, специфичные для сотен различных последовательностей, были идентифицированы и синтезированы для продажи лабораториям, и в результате несколько потенциальных сайтов рестрикции появляются почти в любом гене или локусе, представляющем интерес, на любой хромосоме. Кроме того, почти все искусственные плазмиды включают (часто полностью синтетический) полилинкер (также называемый «множественным сайтом клонирования»), который содержит десятки последовательностей распознавания ферментов рестрикции в пределах очень короткого сегмента ДНК. Это позволяет вставлять практически любой специфический фрагмент ДНК в плазмидные векторы, которые могут быть эффективно «клонированы» путем введения в реплицирующиеся бактериальные клетки. После рестрикционного переваривания ДНК можно анализировать с помощью электрофореза в агарозном геле. При электрофорезе в геле образец ДНК сначала «загружают» на пластину агарозного геля (буквально пипетируют в небольшие лунки на одном конце пластины). Затем гель подвергают воздействию электрического поля, которое притягивает отрицательно заряженную ДНК через него. Молекулы движутся с разной скоростью (и, следовательно, оказываются на разных расстояниях) в зависимости от их чистого заряда (более сильно заряженные частицы движутся дальше) и размера (меньшие частицы движутся дальше). Поскольку ни одно из четырех нуклеотидных оснований не несет заряда, чистый заряд становится незначительным, а размер является основным фактором, влияющим на скорость диффузии через гель. Чистый заряд в ДНК обусловлен фосфодиэфирным остовом. Это отличается от белков, в которых нет «остова», и чистый заряд генерируется различными комбинациями и количеством заряженных аминокислот.
A given restriction enzyme cuts DNA segments within a specific nucleotide sequence, at what is called a restriction site. These recognition sequences are typically four, six, eight, ten, or twelve nucleotides long and generally palindromic (i. e. the same nucleotide sequence in the 5' – 3' direction). Because there are only so many ways to arrange the four nucleotides that compose DNA (Adenine, Thymine, Guanine and Cytosine) into a four to twelve nucleotide sequence, recognition sequences tend to occur by chance in any long sequence. Restriction enzymes specific to hundreds of distinct sequences have been identified and synthesized for sale to laboratories, and as a result, several potential "restriction sites" appear in almost any gene or locus of interest on any chromosome. Furthermore, almost all artificial plasmids include a (often entirely synthetic) polylinker (also called "multiple cloning site") that contains dozens of restriction enzyme recognition sequences within a very short segment of DNA. This allows the insertion of almost any specific fragment of DNA into plasmid vectors, which can be efficiently "cloned" by insertion into replicating bacterial cells. After restriction digest, DNA can then be analysed using agarose gel electrophoresis. In gel electrophoresis, a sample of DNA is first "loaded" onto a slab of agarose gel (literally pipetted into small wells at one end of the slab). The gel is then subjected to an electric field, which draws the negatively charged DNA across it. The molecules travel at different rates (and therefore end up at different distances) depending on their net charge (more highly charged particles travel further), and size (smaller particles travel further). Since none of the four nucleotide bases carry any charge, net charge becomes insignificant and size is the main factor affecting rate of diffusion through the gel. Net charge in DNA is produced by the sugar phosphate backbone. This is in contrast to proteins, in which there is no "backbone", and net charge is generated by different combinations and numbers of charged amino acids.
Различные рестрикционные ферменты
Существует множество типов рестрикционных ферментов, каждый из которых разрезает ДНК по-разному. Наиболее часто используемые рестрикционные ферменты – это рестрикционные эндонуклеазы II типа (см. статью о рестрикционных ферментах для примеров). Некоторые разрезают последовательности из трех пар оснований, другие – из четырех, шести и даже восьми. Каждый фермент обладает уникальными свойствами, определяющими эффективность и условия его работы. Большинство производителей таких ферментов обычно предоставляют специальный буферный раствор, содержащий уникальную смесь катионов и других компонентов, способствующих наиболее эффективному разрезанию. Различные рестрикционные ферменты могут также иметь разные оптимальные температуры функционирования. Важно отметить, что для эффективного переваривания ДНК участок рестрикции не должен располагаться непосредственно на конце фрагмента ДНК. Рестрикционным ферментам может потребоваться минимальное количество пар оснований между участком рестрикции и концом ДНК для эффективной работы. Это число может варьироваться в зависимости от фермента, но для большинства часто используемых рестрикционных ферментов достаточно около 6–10 пар оснований.
There are numerous types of restriction enzymes, each of which will cut DNA differently. Most commonly used restriction enzymes are Type II restriction endonuclease (See article on Restriction enzymes for examples). There are some that cut a three base pair sequence while others can cut four, six, and even eight. Each enzyme has distinct properties that determine how efficiently it can cut and under what conditions. Most manufacturers that produce such enzymes will often provide a specific buffer solution that contains the unique mix of cations and other components that aid the enzyme in cutting as efficiently as possible. Different restriction enzymes may also have different optimal temperatures under which they function. Note that for efficient digest of DNA, the restriction site should not be located at the very end of a DNA fragment. The restriction enzymes may require a minimum number of base pairs between the restriction site and the end of the DNA for the enzyme to work efficiently. This number may vary between enzymes, but for most commonly used restriction enzymes around 6–10 base pair is sufficient.