Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Молекулалық биология техникасы
Molecular biology technique
Ген экспрессиясының сериялық талдауы (SAGE) – молекулалық биологтардың қызығушылық тудыратын сынамадағы хабаршы РНК популяциясының «тікелей суретін» сол транскрипттердің фрагменттеріне сәйкес келетін шағын тегтер түрінде алуға мүмкіндік беретін транскриптомикалық техника. Одан бері бірнеше түрлері жасалды, олардың ішінде ең маңыздылары – LongSAGE, RL SAGE және ең соңғы SuperSAGE. Бұл түрлердің көпшілігі ұзақ тегтерді анықтау арқылы бастапқы генді анықтауды дәлдеуге көмектеседі.
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) is a transcriptomic technique used by molecular biologists to produce a snapshot of the messenger RNA population in a sample of interest in the form of small tags that correspond to fragments of those transcripts. Several variants have been developed since, most notably a more robust version, LongSAGE, RL SAGE and the most recent SuperSAGE. Many of these have improved the technique with the capture of longer tags, enabling more confident identification of a source gene.
Талдау
SAGE нәтижесі – қысқа реттілік тегтерінің тізімі және олардың қанша рет кездесетіні. Реттік деректер базасын қолдану арқылы зерттеуші, көбінесе, тег қай бастапқы мРНҚ-дан (демек, қай геннен) алынғанын біршама сенімділікпен анықтай алады. Әртүрлі сынамалардан алынған тегтер мен сандар тізіміне статистикалық әдістер қолданылып, қай гендердің белсенділігі жоғары екенін анықтауға болады. Мысалы, қалыпты тіндің сынамасын сәйкес келетін ісікпен салыстыру арқылы, қай гендердің белсенділігі жоғары (немесе төмен) екенін анықтауға болады.
The output of SAGE is a list of short sequence tags and the number of times it is observed. Using sequence databases a researcher can usually determine, with some confidence, from which original mRNA (and therefore which gene) the tag was extracted. Statistical methods can be applied to tag and count lists from different samples in order to determine which genes are more highly expressed. For example, a normal tissue sample can be compared against a corresponding tumor to determine which genes tend to be more (or less) active.
Тарих
1979 жылы Гарвард және Калтех университеттерінің командалары мРНК-ның ДНК көшірмелерін in vitro жасаудың негізгі идеясын бактериялық плазмидтердегі мұндай кітапхананы күшейтуге дейін дамытты. 1982–1983 жылдары Грег Сатклифф және оның әріптестері, сондай-ақ Putney және тағы басқалар мұндай кДНК кітапханасынан реттілеу үшін кездейсоқ немесе жартылай кездейсоқ клондарды іріктеу идеясын зерттеді. Олар қоян етінің мРНК кітапханасынан 178 клонды реттіледі. 1991 жылы Адамс және оның әріптестері «экспрессияланған реттілік белгісі» (EST) терминін енгізіп, cDNA-ны жүйелі түрде реттілеу жобасын бастады (600 ми ДНК-сынан бастап). EST-лерді анықтау жылдам дамыды, қазір миллиондаған EST-лер қоғамдық дерекқорларда қолжетімді (мысалы, GenBank). 1995 жылы белгінің ұзындығын 100–800 бп-дан 10–22 бп-ға дейін қысқарту идеясы мРНК зерттеулерінің құнын төмендетуге көмектесті. Осы жылы Виктор Велюлеску Джонс Хопкинс университетінің Онкология орталығында SAGE протоколын жариялады. Robust LongSage (RL SAGE) бұрынғы LongSAGE протоколымен салыстырғанда, 50 нг мРНК енгізу көлемі бар кітапхана жасау мүмкіндігін ұсына отырып, LongSAGE протоколын одан әрі жетілдірді (бұрынғы LongSAGE енгізу көлемі 2 мкг мРНК болған).
In 1979 teams at Harvard and Caltech extended the basic idea of making DNA copies of mRNAs in vitro to amplifying a library of such in bacterial plasmids. In 1982–1983, the idea of selecting random or semi random clones from such a cDNA library for sequencing was explored by Greg Sutcliffe and coworkers. and Putney et al. who sequenced 178 clones from a rabbit muscle cDNA library. In 1991 Adams and co workers coined the term expressed sequence tag (EST) and initiated more systematic sequencing of cDNAs as a project (starting with 600 brain cDNAs). The identification of ESTs proceeded rapidly, millions of ESTs now available in public databases (e. g. GenBank). In 1995, the idea of reducing the tag length from 100 to 800 bp down to tag length of 10 to 22 bp helped reduce the cost of mRNA surveys. In this year, the original SAGE protocol was published by Victor Velculescu at the Oncology Center of Johns Hopkins University. Robust LongSage (RL SAGE) Further improved on the LongSAGE protocol with the ability to generate a library with an insert size of 50 ng mRNA, much smaller than previous LongSAGE insert size of 2 μg mRNA
SuperSAGE
SuperSAGE – SAGE-дің туындысы болып табылады, ол әр транскрипттің cDNA-сынан 26 жұп негіздік (bp) тізбекті тегтерді кесу үшін фаг P1-дің III типті эндонуклеазасы EcoP15I-ді пайдаланады, бұл тег өлшемін алдыңғы SAGE және LongSAGE әдістерімен салыстырғанда кем дегенде 6 жұп негіздік (bp) кеңейтеді. Тегтің ұзындығының артуы тегтің сәйкес транскриптке дәлірек тағайындалуына мүмкіндік береді, өйткені әрбір қосымша негіз аннотацияның дәлдігін едәуір арттырады. Түпнұсқа SAGE протоколындағыдай, сопақ ұштарлы тегтерді пайдалана отырып, дитагтар деп аталатын құрылымдар қалыптастырылады. Алайда, SuperSAGE LongSAGE 20 жұп негіздік (bp) дитагтардың қосылуы кезінде байқалған, нашар кездейсоқтықтан туындаған бұрмалаушылықты болдырмайды. Жоғары өнімді тізбектеу әдістерімен (келесі буын тізбектеу, яғни пиросекуендеу) тікелей тізбектеу арқылы жүз мыңдаған немесе миллиондаған тегтерді бір мезгілде талдауға болады, нәтижесінде өте дәл және сандық ген экспрессиясы профильдері алынады. Сондықтан, "цифрлық ген экспрессиясы профильдеу" (DGE) деп аталатын тегке негізделген ген экспрессиясы профильдеуі бүгінде микромассивтердің шектеулерін жеңіп, ең дәл транскрипция профильдерін ұсынуға қабілетті.
SuperSAGE is a derivative of SAGE that uses the type III endonuclease EcoP15I of phage P1, to cut 26 bp long sequence tags from each transcript's cDNA, expanding the tag size by at least 6 bp as compared to the predecessor techniques SAGE and LongSAGE. The longer tag size allows for a more precise allocation of the tag to the corresponding transcript, because each additional base increases the precision of the annotation considerably. Like in the original SAGE protocol, so called ditags are formed, using blunt ended tags. However, SuperSAGE avoids the bias observed during the less random LongSAGE 20 bp ditag ligation. By direct sequencing with high throughput sequencing techniques (next generation sequencing, i. e. pyrosequencing), hundred thousands or millions of tags can be analyzed simultaneously, producing very precise and quantitative gene expression profiles. Therefore, tag based gene expression profiling also called "digital gene expression profiling" (DGE) can today provide most accurate transcription profiles that overcome the limitations of microarrays.
3'end mRNA тізбектеу, cDNA ұштарының үлкен талдау
2010 жылдардың ортасында Next Generation Sequencing (NGS) технологиясымен үйлестірілген, "цифрлық ген экспрессиясын профильдеу" үшін "белгілеу" принципін қолданатын, бірақ белгілеу ферментін пайдаланбайтын бірнеше әдістер әзірленді. "MACE" әдісі, (= cDNA аяқтарының жаппай талдауы) транскрипттың соңғы 1500 базалық жұбының ішінде белгілерді жасайды. Бұл әдіс енді рестрикциялық ферменттерге тәуелді емес, соның салдарынан кДНК-да рестрикциялық сайттың болмауына немесе орналасуына байланысты болатын қателіктерді болдырмайды. Оның орнына, кДНК кездейсоқ фрагменттерге бөлінеді және поли(А) құйрығын тасымалдайтын кДНК молекуласының 5' ұшынан 3' ұштары секвенделенеді. Белгінің секвендеу ұзындығы еркін таңдалуы мүмкін. Осының арқасында белгілер контигтерге жинақталып, белгілердің аннотациясы едәуір жақсарылатыны мүмкін. Сондықтан MACE үлгілік емес организмдерді талдау үшін де қолданылады. Сонымен қатар, ұзын контигтерді полиморфизмдерге сәйкес тексеруге болады. UTR-лерде жеке адамдар арасында көптеген полиморфизмдер кездесетіндіктен, MACE әдісі аллельді анықтау, аллельге қатысты ген экспрессиясын профильдеу және селекция үшін молекулалық маркерлерді іздеу үшін қолданылуы мүмкін. Бұдан өзге, бұл әдіс транскрипттердің баламалы полиадениляциясын анықтауға мүмкіндік береді. MACE тек транскрипттердің 3' ұштарын қажет ететіндіктен, тіпті ішінара ыдыраған РНК-ны да ыдырауға байланысты қателіктердің аз болуымен талдауға болады. MACE әдісі ПТР қателіктерін анықтау үшін бірегей молекулалық идентификаторларды пайдаланады.
In the mid 2010s several techniques combined with Next Generation Sequencing were developed that employ the "tag" principle for "digital gene expression profiling" but without the use of the tagging enzyme. The "MACE" approach, (=Massive Analysis of cDNA Ends) generates tags somewhere in the last 1500 bps of a transcript. The technique does not depend on restriction enzymes anymore and thereby circumvents bias that is related to the absence or location of the restriction site within the cDNA. Instead, the cDNA is randomly fragmented and the 3'ends are sequenced from the 5' end of the cDNA molecule that carries the poly A tail. The sequencing length of the tag can be freely chosen. Because of this, the tags can be assembled into contigs and the annotation of the tags can be drastically improved. Therefore, MACE is also use for the analyses of non model organisms. In addition, the longer contigs can be screened for polymorphisms. As UTRs show a large number of polymorphisms between individuals, the MACE approach can be applied for allele determination, allele specific gene expression profiling and the search for molecular markers for breeding. In addition, the approach allows determining alternative polyadenylation of the transcripts. Because MACE does only require 3’ ends of transcripts, even partly degraded RNA can be analyzed with less degradation dependent bias. The MACE approach uses unique molecular identifiers to allow for identification of PCR bias.