ДНҚ фрагментациясы: себептері, әдістері және маңызы

Кіріспе

ДНК талшықтарының бөлінуі немесе үзілуі – ДНК талшықтарының бөлінуі немесе үзілуі. Бұл зертхана қызметкерлері немесе жасушалар арқылы қасақана жасалуы мүмкін, немесе өздігінен туындауы мүмкін. Өздігінен немесе кездейсоқ ДНК фрагментациясы – жасушада біртіндеп жинақталатын үзілу. Оны, мысалы, Комет әдісі немесе TUNEL әдісі арқылы өлшеуге болады. Оның негізгі өлшем бірлігі – ДНК фрагментациясының индексі (DFI). 20% немесе одан жоғары DFI ICSI процедурасынан кейінгі сәттілік деңгейін айтарлықтай төмендетеді.

Қасақана

ДНҚ фрагментациясы кітапхана құру немесе ДНҚ тізбектерін субклондау алдында жиі қажет болады. ДНҚ-ны механикалық түрде бөлшектеудің әртүрлі әдістері қолданылған, онда ДНҚ-ны зертхана қызметкерлері фрагменттейді. Мұндай әдістерге соникация, инемен кесу, тұмандыру, нүктелік шұңқырмен кесу және қысым камерасы арқылы өткізу жатады. Шешілімдік дигест – ДНҚ тізбектерін қасақана үзу. Бұл биотехнологияда жеке адамдар арасындағы фрагмент ұзындығының айырмашылықтарын зерттеу немесе гендерді клондау үшін ДНҚ-ны кішірек бөліктерге кесуге қолданылатын ферментке негізделген емдеу. Бұл әдіс ДНҚ-ны екі тізбектің бір мезгілде үзілуі арқылы немесе әрбір екі тізбекті ДНҚ-да (dsDNA) үзілістер жасау арқылы фрагменттейді. ДНҚ кітапханасына жоғары жиілікті акустикалық энергия толқындарын жеткізу – акустикалық кесу. Трансдьюсер ыдыс тәрізді, сондықтан толқындар қызығушылық тудыратын нысанаға жиналады. Гидродинамикалық кесудің бір түрі – соникация, ол ДНК-ны акустикалық кавитацияға және соникацияның қысқа мерзімдік әсерінен гидродинамикалық кесуге ұшыратады, әдетте 700 bp фрагменттер пайда болады. ДНҚ фрагментациясы үшін соникация көбінесе зондтық соникаторды қолдана отырып, импульстік циклдарда қолданылады. Нүктелік кесу, гидродинамикалық кесудің бір түрі, ДНК кітапханасын кішкентай күрт тарылу арқылы итеру арқылы гидродинамикалық кесу күштерін жасау үшін шприцтік сорғыны пайдаланады. Фрагмент ұзындығының шамамен 90% екі еселік диапазонға түседі. Апоптоздық ДНҚ фрагментациясы үшін жауапты фермент – каспазамен белсендірілген DNase (CAD). CAD әдетте басқа белок – каспазамен белсендірілген DNase ингибиторы (ICAD) арқылы тежеледі. Апоптоз кезінде апоптоздық эффектор каспазасы, каспаза-3, ICAD-ті кесіп, CAD-тің белсенділігіне себеп болады. CAD ДНК-ны нуклеосомалар арасындағы интернуклеосомалық байланыстырушы жерлерде кеседі, бұл хроматинде ~180 bp интервалмен кездесетін белок құрылымдары. Себебі ДНК әдетте гистондардың айналасына тығыз оралған, нуклеосомалардың негізгі белоктары. Байланыстырушы жерлер – ДНК тізбегінің жалғыз ашық және CAD-ға қолжетімді бөліктері. Сперматозоидтардың қозғалмалылығының бұзылуы бар еркектерде сперматозоидтар ДНҚ фрагментациясы жиі кездеседі. Сперматозоидтардағы ДНҚ фрагментациясының деңгейі in vitro ұрықтандыру (IVF) және оның кеңейтілген түрі – интрацитоплазмалық сперматозоидтар инъекциясының нәтижелерін болжауға мүмкіндік береді. Ақ жарық микроскопиясын қолдану арқылы SCD тесті TUNEL талдауынан гөрі сезімтал болып көрінеді. Полимераза тізбектік реакция (ПЦР) талдауында биологиялық үлгіден ДНК-ның миллиондаған нақты көшірмелері жасалады. Ол ДНК тізбегінің белгілі бір аймағын (ДНК мақсатын) күшейту үшін қолданылады. Көптеген ПЦР әдістері әдетте 0,1 мен 10 килобазалық жұптар (kb) аралығындағы ДНК фрагменттерін күшейтеді, бірақ кейбір техникалар фрагменттерді 40 kb дейін күшейтуге мүмкіндік береді.

DNA fragmentation is often necessary prior to library construction or subcloning for DNA sequences. A variety of methods involving the mechanical breakage of DNA have been employed where DNA is fragmented by laboratory personnel. Such methods include sonication, needle shear, nebulisation, point sink shearing and passage through a pressure cell. Restriction digest is the intentional laboratory breaking of DNA strands. It is an enzyme based treatment used in biotechnology to cut DNA into smaller strands in order to study fragment length differences among individuals or for gene cloning. This method fragments DNA either by the simultaneous cleavage of both strands, or by generation of nicks on each strand of dsDNA to produce dsDNA breaks. Acoustic shearing of the transmission of high frequency acoustic energy waves delivered to a DNA library. The transducer is bowl shaped so that the waves converge at the target of interest. Sonication, a type of hydrodynamic shearing, subjects DNA to acoustic cavitation and hydrodynamic shearing by exposure to brief periods of sonication, usually resulting in 700bp fragments. For DNA fragmentation, sonication is commonly applied at burst cycles using a probe type sonicator. Point sink shearing, a type of hydrodynamic shearing, uses a syringe pump to create hydrodynamic shear forces by pushing a DNA library through a small abrupt contraction. About 90% of fragment lengths fall within a two fold range. The enzyme responsible for apoptotic DNA fragmentation is the Caspase activated DNase. CAD is normally inhibited by another protein, the Inhibitor of Caspase Activated DNase (ICAD). During apoptosis, the apoptotic effector caspase, caspase 3, cleaves ICAD and thus causes CAD to become activated. CAD cleaves the DNA at the internucleosomal linker sites between the nucleosomes, protein containing structures that occur in chromatin at ~180 bp intervals. This is because the DNA is normally tightly wrapped around histones, the core proteins of the nucleosomes. The linker sites are the only parts of the DNA strand that are exposed and thus accessible to CAD. Men with sperm motility defects often have high levels of sperm DNA fragmentation. The degree of DNA fragmentation in sperm cells can predict outcomes for in vitro fertilization (IVF) and its expansion intracytoplasmic sperm injection Using bright field microscopy, the SCD test appears to be more sensitive than the TUNEL assay. In polymerase chain reaction (PCR) analysis, millions of exact copies of DNA from a biological sample are made. It used to amplify a specific region of a DNA strand (the DNA target). Most PCR methods typically amplify DNA fragments of between 0.1 and 10 kilo base pairs (kb), although some techniques allow amplification of fragments up to 40 kb in size.