Фрагментация ДНК: методы, причины и влияние на репродуктивные технологии.

Введение

Фрагментация ДНК — это разделение или разрыв цепей ДНК на фрагменты. Она может быть выполнена намеренно лабораторными сотрудниками или клетками, либо может происходить спонтанно. Спонтанная или случайная фрагментация ДНК — это фрагментация, которая постепенно накапливается в клетке. Её можно измерить, например, с помощью кометного теста или TUNEL-теста. Основной единицей измерения является индекс фрагментации ДНК (DFI). Значение DFI 20% и выше значительно снижает показатели успешности после ИКСИ.

Умышленно

Фрагментация ДНК часто необходима перед созданием библиотеки или субклонированием ДНК-последовательностей. Используется множество методов, включающих механическое разрушение ДНК, при котором фрагментация ДНК выполняется лабораторным персоналом. К таким методам относятся соникация, фрагментация иглой, небулизация, фрагментация точечным источником и прохождение через камеру с давлением. Рестрикционный анализ – это намеренное лабораторное разрывание цепей ДНК. Это ферментный метод, используемый в биотехнологии для разрезания ДНК на более мелкие фрагменты с целью изучения различий в длине фрагментов между индивидуумами или для клонирования генов. Этот метод фрагментирует ДНК либо путем одновременного расщепления обеих цепей, либо путем создания разрывов (ников) на каждой цепи двухцепочечной ДНК (дсДНК) для образования разрывов дсДНК. Акустическое сдвиговое воздействие заключается в передаче высокочастотной акустической энергии на библиотеку ДНК. Преобразователь имеет вогнутую форму, чтобы волны сходились в интересующей области. Соникация, являющаяся типом гидродинамического сдвига, подвергает ДНК акустической кавитации и гидродинамическому сдвигу при кратковременном воздействии ультразвука, обычно приводя к образованию фрагментов размером 700 пар оснований (bp). Для фрагментации ДНК соникация обычно применяется импульсными циклами с использованием зондового соникатора. Фрагментация точечным источником, также являющаяся типом гидродинамического сдвига, использует шприцевой насос для создания гидродинамических сил сдвига путем проталкивания библиотеки ДНК через небольшое резкое сужение. Примерно 90% фрагментов имеют длину в пределах двукратного диапазона. Фермент, ответственный за апоптотическую фрагментацию ДНК, – это DNase, активируемая каспазой (CAD). CAD обычно ингибируется другим белком – ингибитором DNase, активируемой каспазой (ICAD). Во время апоптоза апоптотический эффектор, каспаза-3, расщепляет ICAD, тем самым активируя CAD. CAD расщепляет ДНК в интернуклеосомных линкерных участках между нуклеосомами – структурами, содержащими белки, которые встречаются в хроматине с интервалами около 180 пар оснований. Это связано с тем, что ДНК обычно плотно упакована вокруг гистонов, основных белков нуклеосом. Линкерные участки – это единственные участки цепи ДНК, которые не защищены белками и, следовательно, доступны для CAD. У мужчин с дефектами подвижности сперматозоидов часто наблюдается высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов. Степень фрагментации ДНК в клетках сперматозоидов может предсказывать результаты экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и его разновидности – интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). При использовании световой микроскопии тест SCD, по-видимому, более чувствителен, чем анализ TUNEL. В анализе полимеразной цепной реакции (ПЦР) создаются миллионы точных копий ДНК из биологического образца. Он используется для амплификации определенного участка цепи ДНК (ДНК-мишени). Большинство методов ПЦР обычно амплифицируют фрагменты ДНК размером от 0,1 до 10 килобаз (кб), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты размером до 40 кб.

DNA fragmentation is often necessary prior to library construction or subcloning for DNA sequences. A variety of methods involving the mechanical breakage of DNA have been employed where DNA is fragmented by laboratory personnel. Such methods include sonication, needle shear, nebulisation, point sink shearing and passage through a pressure cell. Restriction digest is the intentional laboratory breaking of DNA strands. It is an enzyme based treatment used in biotechnology to cut DNA into smaller strands in order to study fragment length differences among individuals or for gene cloning. This method fragments DNA either by the simultaneous cleavage of both strands, or by generation of nicks on each strand of dsDNA to produce dsDNA breaks. Acoustic shearing of the transmission of high frequency acoustic energy waves delivered to a DNA library. The transducer is bowl shaped so that the waves converge at the target of interest. Sonication, a type of hydrodynamic shearing, subjects DNA to acoustic cavitation and hydrodynamic shearing by exposure to brief periods of sonication, usually resulting in 700bp fragments. For DNA fragmentation, sonication is commonly applied at burst cycles using a probe type sonicator. Point sink shearing, a type of hydrodynamic shearing, uses a syringe pump to create hydrodynamic shear forces by pushing a DNA library through a small abrupt contraction. About 90% of fragment lengths fall within a two fold range. The enzyme responsible for apoptotic DNA fragmentation is the Caspase activated DNase. CAD is normally inhibited by another protein, the Inhibitor of Caspase Activated DNase (ICAD). During apoptosis, the apoptotic effector caspase, caspase 3, cleaves ICAD and thus causes CAD to become activated. CAD cleaves the DNA at the internucleosomal linker sites between the nucleosomes, protein containing structures that occur in chromatin at ~180 bp intervals. This is because the DNA is normally tightly wrapped around histones, the core proteins of the nucleosomes. The linker sites are the only parts of the DNA strand that are exposed and thus accessible to CAD. Men with sperm motility defects often have high levels of sperm DNA fragmentation. The degree of DNA fragmentation in sperm cells can predict outcomes for in vitro fertilization (IVF) and its expansion intracytoplasmic sperm injection Using bright field microscopy, the SCD test appears to be more sensitive than the TUNEL assay. In polymerase chain reaction (PCR) analysis, millions of exact copies of DNA from a biological sample are made. It used to amplify a specific region of a DNA strand (the DNA target). Most PCR methods typically amplify DNA fragments of between 0.1 and 10 kilo base pairs (kb), although some techniques allow amplification of fragments up to 40 kb in size.