Бөлшектерді санау және өлшеу құрылғысы

Кіріспе

Бөлшектерді санау және өлшеуге арналған құрылғы

Coulter санағышы – электролиттердегі суспензияланған бөлшектерді санауға және өлшеуге арналған аппарат. Coulter санағышы – резистивті импульсті сезіктеу немесе электрлік аймақты сезіктеу деп аталатын әдістің коммерциялық атауы. Аппараттың жұмыс ілу принципі оның авторы Уоллес Х. Колтердің атымен аталған Колтер принципіне негізделген. Типтік Coulter санағышы электролит ерітінділері бар екі камераны бөлетін бір немесе бірнеше микроканалға ие. Бөлшектер мен жасушаларды қамтитын сұйықтық микроканалдар арқылы сорылғанда, әрбір бөлшек сұйықтықтың электр кедергісінде қысқа мерзімді өзгеріс тудырады. Санағыш осы электр кедергісінің өзгерістерін анықтайды.

Коултер принципі

Коултер принципі бойынша, электр тогымен бірге тесіктен өтетін бөлшектер, тесіктен өтетін бөлшектің көлеміне пропорционалды импеданс өзгерісін тудырады. Импеданстағы бұл импульс бөлшектердің электролитті ығыстыруынан пайда болады. Коултер принципі, электр өрісінде қозғалатын бөлшектердің сол өрісте өлшенетін бұзылыстарға себеп болатынына негізделген. Бұл бұзылыстардың мөлшері, өрістегі бөлшектердің өлшемдеріне пропорционалды. Коултер осы құбылыстың практикалық қолданылуы үшін қажетті бірнеше талаптарды анықтады: бөлшектер өткізгіш сұйықтықта суспензияланған болуы керек. Электр өрісі физикалық тұрғыдан шектелуі керек, сонда бөлшектердің өрістегі қозғалысы токта байқалатын өзгерістерге әкеледі. Бөлшектер физикалық шектеуден бір уақытта тек бір ғана өтуі үшін жеткілікті мөлшерде сұйылтылуы керек. Егер бірнеше бөлшек бір уақытта шектеуден өтсе, олардың импеданс профильдері үйлесіп кетеді, нәтижесінде «коинциденция» деп аталатын артефакт пайда болады. Аппарат бір үлкен бөлшекті бірнеше кішкентай, біріккен бөлшектерден ажырата алмайды, бұл алынған деректерде аномалияларға себеп болады. Коултер принципіне негізделген түрлі эксперименталды құрылғылар жасалған. Осы құрылғылардың бір бөлігі коммерцияландырылған, ең танымал қолданылуы медициналық сала, әсіресе гематологияда – қанның әртүрлі жасушаларын санау және өлшеу үшін. Коултер принципінің барлық іске асырылымдары сезімталдық, шуды қорғау, еріткіштермен үйлесімділік, өлшеу жылдамдығы, сынама көлемі, динамикалық диапазон және құрылғыны өндірудің сенімділігі арасындағы шарттарды қарастырады.

Даму

Уоллес Х. Коултер Коултер принципін 1940 жылдардың соңында ашқан, бірақ патент 1953 жылдың 20 қазанында ғана берілген. Коултерге Хиросима мен Нагасакиге тасталған атом бомбаларының әсері тиді, бұл оны ядролық соғыс жағдайында қажет болатын кең ауқымды скрининг үшін толыққанды қан есебін жақсартуға және оңайлатуға ынталандырды. Жобаның қаржыландыруының бір бөлігі Теңіз зерттеулер басқармасынан алынған грант есебінен жүзеге асты. Коултерге АҚШ патенті № (нөмірі) 2 656 508, «Сұйықтықтағы бөлшектерді санау құралы» берілді. Бұл Коултер санағы – Коултер принципін қолданатын, ең көп кездеретіні – жасушаларды санайтын талдау құралы. Коултер принципін коммерциялық тұрғыдан ең табысты қолданылуы гематологияда, онда ол пациенттердің қан жасушалары туралы ақпарат алу үшін қолданылады. Коултер санағы сондай-ақ бояу, керамика, шыны, металл және тағам өңдеу және өндірісінде де қолданылуы мүмкін. Олар сапаны бақылау үшін де жүйелі түрде қолданылады. Жасушалар нашар өткізгіш бөлшектер болғандықтан, өткізгіш микроканалдың тиімді көлденең қимасын өзгертеді. Егер бұл бөлшектер айналадағы сұйық ортадан нашар өткізгіш болса, каналдағы электр кедергісі артады, нәтижесінде канал арқылы өтетін электр тогы қысқа мерзімге төмендейді. Мұндай электр тогы импульстарын бақылау арқылы сұйықтың белгілі бір көлеміндегі бөлшектердің санын санауға болады. Электр тогының өзгеру мөлшері бөлшектің мөлшерімен байланысты, бұл бөлшектердің қозғалыс қабілетіне, беттік зарядына және концентрациясына байланысты бөлшектердің мөлшері бойынша үлестірімін өлшеуге мүмкіндік береді. Коултер санағындағы сигналды өңдеу тізбегіне байланысты алынған деректердің мөлшері мен сапасы айтарлықтай өзгереді. Төменгі шу деңгейі және жоғары динамикалық диапазоны бар күшейткіштер жүйенің сезімталдығын арттыра алады, ал айнымалы жиек ені бар сандық импульс биіктігі анализаторлары тұрақты жиектері бар аналогтық анализаторлармен салыстырғанда әлдеқайда жоғары ажыратымдылықты деректерді ұсынады. Коултер санағын цифрлық компьютермен біріктіру көптеген электр импульстарының сипаттамаларын тіркеуге және талдауға мүмкіндік береді, ал аналогтық санағыштар әдетте әрбір импульс туралы шектеулі ақпарат сақтайды. Электр тогын анықтау құрылғылары сезімталданып, арзандаған сайын Коултер санағы толыққанды қан есебін (ТҚЕ) жылдам және дәл талдау үшін әдеттегі ауруханалық зертханалық құралға айналды. ТҚЕ денедегі ақ және қызыл қан жасушаларының санын немесе пропорциясын анықтау үшін қолданылады. Бұрын бұл процедура перифериялық қанның жағын дайындауды және микроскоп астында әрбір жасуша түрін қолмен санауды қамтыды, бұл процесс әдетте жарты сағатқа созылатын. Коултер санағы алғашқы жасушаларды сұрыптауды дамытуда маңызды рөл атқарды және ағын цитометриясының ерте дамуына қатысты. Кейбір ағын цитометрлері жасушалардың мөлшері мен санын анықтау үшін Коултер принципін пайдалануды жалғастыруда.

Wallace H. Coulter discovered the Coulter principle in the late 1940s, though a patent was not awarded until October 20, 1953. Coulter was influenced by the atomic bombs dropped on Hiroshima and Nagasaki, which motivated him to improve and streamline complete blood counting for use in large scale screening, as would be necessary in the event of a nuclear war. Partial funding of the project came from a grant award from the Office of Naval Research. Coulter was awarded US Patent No. (number) 2,656,508, Means for Counting Particles Suspended in a Fluid. This Coulter counter is an analytical instrument which employs the Coulter principle for a specific task, most commonly counting cells. The most commercially successful application of the Coulter principle is in hematology, where it is used to obtain information about patients' blood cells. Coulter counters can also be used in the processing and manufacturing of paint, ceramics, glass, metals, and food. They are also routinely employed for quality control. Cells, being poorly conductive particles, alter the effective cross section of the conductive microchannel. If these particles are less conductive than the surrounding liquid medium, the electrical resistance across the channel increases, causing the electric current passing across the channel to briefly decrease. By monitoring such pulses in electric current, the number of particles for a given volume of fluid can be counted. The size of the electric current change is related to the size of the particle, enabling a particle size distribution to be measured, which can be correlated to mobility, surface charge, and concentration of the particles. The amount and quality of data obtained varies greatly as a function of the signal processing circuitry in the Coulter counter. Amplifiers with lower noise thresholds and greater dynamic range can increase the sensitivity of the system, and digital pulse height analyzers with variable bin widths provide much higher resolution data as compared to analog analyzers with fixed bins. Combining a Coulter counter with a digital computer allows capture and analysis of many electrical pulse characteristics, while analog counters typically store a limited amount of information about each pulse. As electric current detectors became more sensitive and less expensive, the Coulter counter became a common hospital laboratory instrument for quick and accurate analysis of complete blood counts (CBC). The CBC is used to determine the number or proportion of white and red blood cells in the body. Previously, this procedure involved preparing a peripheral blood smear and manually counting each type of cell under a microscope, a process that typically required a half hour. A Coulter counter played an important role in the development of the first cell sorter, and was involved in the early development of flow cytometry. Some flow cytometers continue to utilize the Coulter principle to provide information about cell size and count.

Форматтар

Коултерлік есептегіштің түрлі жолдармен жасалуы мүмкін болғанымен, коммерциялық тұрғыдан ең маңызды екі басты конфигурация бар: апертуралық формат және ағын жасушасы формат. Апертуралық формат – коммерциялық Коултерлік есептегіштерде ең көп қолданылатын конфигурация және ол сапаны бақылау үшін сынамаларды тексеруге ыңғайлы. Бұл құрылымда белгілі бір мөлшердегі кішкентай апертура (тесік) жасалады, мысалы, сағаттардағы зергерлік подшипниктерде қолданылатын материалдан жасалған зергерлік дискіде.

Эксперименттік ескертулер

Коултерлік есептегіштерді қолдана отырып, сынақ әдістемесін жасауда бірнеше жалпы мәселелер қарастырылады.

Бір кездейсоқтық

Аномальды электр импульстары бірнеше бөлшек бір уақытта апертураға кіргенде пайда болуы мүмкін. Бұл жағдай сәйкестік деп аталады. Себебі, бір үлкен импульстің бір үлкен бөлшектен немесе бірнеше кішкентай бөлшектің бірдей апертураға кіруінен туындағанын анықтау мүмкін емес. Мұндай жағдайды болдырмау үшін үлгілер жеткілікті жұқа болуы керек.

Бөлшектердің жолы

Электр импульсінің пішіні бөлшектің апертура арқылы өту жолына байланысты өзгереді. Егер электр өрісінің тығыздығы апертура диаметрі бойынша өзгерсе, сигнал артефактілері пайда болуы мүмкін. Бұл өзгеріс электр өрісінің физикалық шектелуінен және сұйықтықтың жылдамдығы апертурадағы радиалды орналасуға байланысты өзгеруінен туындайды. Ағын жасушасы форматында бұл әсер азайтылады, себебі қабық ағыны әрбір бөлшектің ағын жасушасы арқылы шамамен бірдей жолмен өтуін қамтамасыз етеді. Апертуралық форматта бөлшектердің өту жолынан туындаған артефактілерді түзету үшін сигналды өңдеу алгоритмдерін қолдануға болады.

Жетекші бөлшектер

Өткізгіш бөлшектер жиі кездеседі, бірақ эксперимент нәтижелеріне сирек әсер етеді. Бұл себебі, көптеген өткізгіш материалдар мен сұйықтықтағы иондар арасындағы өткізгіштік айырмашылығы (бөліну потенциалы деп аталады) соншалықты зор, сондықтан көптеген өткізгіш материалдар Коултер санағышында оқшаулағыштар ретінде танылады. Бұл потенциалдық кедергіні жеңу үшін қажетті кернеу бұзу кернеуі деп аталады. Егер қиындық тудыратын өте өткізгіш материалдар болса, Коултер эксперименті кезінде қолданылатын кернеуді бұзу потенциалынан төмендетуге болады (мұны тәжірибелік жолмен анықтауға болады).

Кеспекті бөлшектер

Коултер принципі нысанның көлемін өлшейді, себебі электр өрісіндегі бұзылу апертурадан ығыстырылған электролит көлеміне пропорционалды. Бұл микроскоптар немесе басқа да жүйелер арқылы оптикалық өлшеулерге үйренген, олар тек екі өлшемді көрініс беретін және нысанның шекараларын көрсететін адамдарда шатасу тудыруы мүмкін. Коултер принципі, керісінше, үш өлшемді және нысанның ығыстырған көлемін өлшейді.

Бірқалыпты ток пен ауыспалы ток

Уоллес Колтер ойлап тапқан Колтер санағы бөлшектерді (клеткаларды) санау үшін тұрақты ток (БЖ) қолданады және клеткалардың мөлшеріне байланысты амплитудалы электр импульстерін шығарады. Клеткаларды электрлік өткізгіш сұйықтықпен қоршалған электрлік изоляторлар ретінде модельдеуге болады, олар электр жолының бір бөлігін бұғаттап, өлшенген кедергіні уақытша көбейтеді. Бұл – Коултер принципі қолданылған ең көп таралған өлшеу жүйесі. Кейінгі дамулар клеткалардың санын ғана санаудың орнына, олардың күрделі электрлік кедергісін зерттеу үшін ауыспалы ток (AC) пайдалану арқылы алынатын ақпаратты кеңейтуге мүмкіндік берді. Клетканы клетка цитоплазмасын қоршап тұрған, өткізгіш болатын оқшаулағыш жасуша мембранасы ретінде шамамен модельдеуге болады. Жасуша мембранасының жұқалығы цитоплазма мен жасушаны қоршап тұрған электролит арасында электр сыйымдылығын тудырады. Электр кедергісі әртүрлі ауыспалы ток жиіліктерінде өлшенуі мүмкін. Төмен жиіліктерде (1 МГц-тен әлдеқайда төмен) кедергі тұрақты ток кедергісіне ұқсас. Дегенмен, МГц диапазонындағы жоғары жиіліктер жасуша мембранасының қалыңдығын зерттеу үшін қолданылуы мүмкін (ол оның сыйымдылығын анықтайды). Көп жоғары жиіліктерде (10 МГц-тен әлдеқайда жоғары) мембрана сыйымдылығының кедергісі өлшенген кедергіге цитоплазманың өзінен үлкен үлес түсетін деңгейге дейін төмендейді (мембрана, негізінен, «қысқа тұйықталады»). Осылайша, әртүрлі жиіліктерді пайдалану арқылы құрал клеткалардың ішкі құрылымы мен құрамына сезімтал бола алады.

Гематология

Коултер санағының ең табысты және маңызды қолданылуы – адам қан жасушаларын мінездеу. Бұл техника түрлі ауруларды диагностикалау үшін пайдаланылған және қызыл қан талшықтарын (RBC) және ақ қан талшықтарын (WBC) санаудың, сондай-ақ бірнеше басқа да жиі кездесетін параметрлерді алудың стандартты әдісі болып табылады. Флуоресценттік белгілеу және жарық себу сияқты басқа технологиялармен үйлестірілгенде, Коултер принципі пациенттің қан жасушаларының толыққанды суретін жасауға көмектеседі.

Ұяшықтардың саны мен көлемі

Қан жасушаларын клиникалық түрде санаудан (жасушалардың диаметрі көбінесе 6–10 микрометр) өзге, Коултер санағы бактериялардан (<1 микрометр көлемде), май жасушаларынан (шамамен 400 микрометр), дің жасушаларының эмбриоидтық денелерінен (шамамен 900 микрометр) және өсімдік жасушаларының топтарынан (>1200 микрометр) бастап, кең ауқымды жасушаларды санау үшін ең сенімді зертханалық әдіс болып бекінді.

Бөлшектерді сипаттау

Коултерлік есептегіштер бөлшектерді олардың оптикалық қасиеттеріне, сезімталдығына және сенімділігіне тәуелді болмай, жеке-жеке өлшеу мүмкіндігі үшін көптеген салаларда қолданылып келеді. Бұл принцип наноөлшемге бейімделіп, нанобөлшектерді сипаттаудың микрофлюидтік резистивтік импульсті сезімталдау (microfluidic resistive pulse sensing) әдістерін және "реттелетін резистивтік импульсті сезімталдау" (TRPS) деп аталатын әдісті сататын коммерциялық кәсіпорынды құрады. TRPS функционалдық дәрі жеткізуге арналған нанобөлшектер, вирусқа ұқсас бөлшектер (VLP), липосомалар, экзосомалар, полимерлік нанобөлшектер және микрокөпіршіктер сияқты әртүрлі нанобөлшектерді жоғары дәлдікпен талдауға мүмкіндік береді.