Введение

Устройство для подсчета и определения размеров частиц

Счетчик Коултера – это прибор для подсчета и определения размеров частиц, взвешенных в электролитах. Счетчик Коултера является коммерческим названием техники, известной как резистивный импульсный зондирование или электрическое зондирование. Принцип работы прибора основан на принципе Коултера, названном в честь его изобретателя Уоллеса Х. Коултера. Типичный счетчик Коултера имеет один или несколько микроканалов, разделяющих две камеры, содержащие электролитные растворы. При прохождении жидкости, содержащей частицы или клетки, через микроканалы, каждая частица вызывает кратковременное изменение электрического сопротивления жидкости. Счетчик регистрирует эти изменения электрического сопротивления.

Принцип Колтера

Принцип Коултера утверждает, что частицы, проходящие через апертуру одновременно с электрическим током, вызывают изменение импеданса, пропорциональное объему частицы, пересекающей апертуру. Этот импульс импеданса возникает из-за вытеснения электролита, вызванного частицей. Принцип Коултера основан на том факте, что частицы, движущиеся в электрическом поле, создают измеримые возмущения в этом поле. Величина этих возмущений пропорциональна размеру частиц в поле. Коултер определил несколько требований, необходимых для практического применения этого явления: частицы должны быть суспендированы в проводящей жидкости. Электрическое поле должно быть физически ограничено таким образом, чтобы движение частиц в поле вызывало обнаружимые изменения тока. Частицы должны быть достаточно разбавлены, чтобы через физическое ограничение проходила только одна частица за раз. Если несколько частиц проходят через ограничение одновременно, их профили импеданса перекрываются, что приводит к артефакту, известному как совпадение. Прибор не может различить одну большую частицу и несколько мелких перекрывающихся частиц, что вызывает аномалии в получаемых данных. На основе принципа Коултера было разработано множество экспериментальных устройств. Некоторые из этих устройств были коммерциализированы, при этом наиболее известные применения находятся в медицинской отрасли, особенно в гематологии, для подсчета и определения размеров различных клеток, составляющих цельную кровь. Все реализации принципа Коултера предполагают компромиссы между чувствительностью, экранированием от шума, совместимостью с растворителями, скоростью измерения, объемом пробы, динамическим диапазоном и надежностью производства приборов.

Разработка

Уоллес Х. Колтер открыл принцип Колтера в конце 1940-х годов, хотя патент был выдан 20 октября 1953 года. На Колтера повлияли атомные бомбардировки Хиросимы и Нагасаки, что побудило его усовершенствовать и оптимизировать общий анализ крови для использования в крупномасштабном скрининге, как это потребовалось бы в случае ядерной войны. Частичное финансирование проекта было получено в виде гранта от Управления военно-морских исследований. Колтер получил патент США № (номер) 2 656 508 на «Устройство для подсчета частиц, взвешенных в жидкости». Этот счетчик Колтера – это аналитический прибор, использующий принцип Колтера для решения конкретной задачи, чаще всего – подсчета клеток. Наиболее коммерчески успешным применением принципа Колтера является гематология, где он используется для получения информации о клетках крови пациентов. Счетчики Колтера также могут применяться в обработке и производстве красок, керамики, стекла, металлов и пищевых продуктов. Они также регулярно используются для контроля качества. Клетки, будучи плохо проводящими частицами, изменяют эффективное поперечное сечение проводящего микроканала. Если эти частицы менее проводящие, чем окружающая жидкая среда, электрическое сопротивление канала увеличивается, что приводит к кратковременному уменьшению электрического тока, проходящего через канал. Путем регистрации этих импульсов электрического тока можно подсчитать количество частиц в заданном объеме жидкости. Величина изменения электрического тока связана с размером частицы, что позволяет измерять распределение частиц по размерам, которое можно соотнести с подвижностью, поверхностным зарядом и концентрацией частиц. Объем и качество получаемых данных значительно варьируются в зависимости от схемы обработки сигналов в счетчике Колтера. Усилители с более низким порогом шума и большим динамическим диапазоном могут повысить чувствительность системы, а цифровые анализаторы высоты импульса с переменной шириной каналов обеспечивают значительно более высокое разрешение данных по сравнению с аналоговыми анализаторами с фиксированной шириной каналов. Комбинирование счетчика Колтера с цифровым компьютером позволяет регистрировать и анализировать множество характеристик электрических импульсов, в то время как аналоговые счетчики обычно хранят ограниченный объем информации о каждом импульсе. По мере того как детекторы электрического тока становились более чувствительными и доступными по цене, счетчик Колтера стал распространенным лабораторным прибором для быстрого и точного анализа общего анализа крови (ОАК). ОАК используется для определения количества или пропорции лейкоцитов и эритроцитов в организме. Ранее для этого требовалось приготовление мазка периферической крови и ручной подсчет каждого типа клеток под микроскопом, что обычно занимало около получаса. Счетчик Колтера сыграл важную роль в разработке первого клеточного сортера и участвовал в раннем развитии проточной цитометрии. Некоторые проточные цитометры продолжают использовать принцип Колтера для получения информации о размере и количестве клеток.

Форматы

Хотя счетчик Кальтера может быть сконструирован различными способами, существует две основные конфигурации, которые получили наибольшее коммерческое распространение: конфигурация с апертурой и конфигурация с проточной ячейкой. Конфигурация с апертурой является наиболее распространенной в коммерческих счетчиках Кальтера и подходит для контроля качества образцов. В этой конструкции небольшое отверстие (апертура) определенного размера создается в материале, таком как драгоценный диск (изготовленный из того же материала, что и оправы подшипников в часах).

Экспериментальные соображения

Существует ряд общих соображений при разработке методологии тестирования с использованием счетчиков Coulter.

Совпадение .

Аномальные электрические импульсы могут генерироваться, если несколько частиц одновременно попадают в апертуру. Это явление известно как совпадение. Это происходит из-за невозможности определить, является ли единичный большой импульс результатом одной крупной частицы или нескольких мелких, вошедших в апертуру одновременно. Чтобы предотвратить эту ситуацию, образцы должны быть достаточно разбавленными.

Путь частиц

Форма генерируемого электрического импульса меняется в зависимости от траектории частицы при прохождении через апертуру. Сигнальные артефакты могут возникать, если плотность электрического поля неоднородна по диаметру апертуры. Эта неоднородность обусловлена как физическим сжатием электрического поля, так и тем, что скорость жидкости меняется в зависимости от радиального положения в апертуре. В формате проточной ячейки этот эффект минимизирован, поскольку боковой поток обеспечивает прохождение каждой частицы практически по одной и той же траектории через ячейку. В формате апертуры для коррекции артефактов, вызванных траекторией частиц, могут использоваться алгоритмы обработки сигналов.

Проводящие частицы

Проводящие частицы – распространенная проблема, но редко влияют на результаты эксперимента. Это объясняется тем, что разница в проводимости между большинством проводящих материалов и ионами в жидкости (обозначаемая как потенциал разряда) настолько велика, что большинство проводящих материалов ведут себя как изоляторы в счетчике Коултера. Напряжение, необходимое для преодоления этого потенциального барьера, называется напряжением пробоя. Для тех высокопроводящих материалов, которые создают проблемы, напряжение, используемое в эксперименте Коултера, можно снизить ниже напряжения пробоя (которое можно определить эмпирическим путем).

Пористые частицы

Принцип Культера измеряет объем объекта, поскольку возмущение в электрическом поле пропорционально объему электролита, вытесненного из апертуры. Это может ввести в заблуждение тех, кто привык к оптическим измерениям, выполняемым с помощью микроскопов или других систем, которые отображают только два измерения и границы объекта. В отличие от этого, принцип Культера измеряет три измерения и объем, вытесняемый объектом.

Прямоточный и переменный ток

Счетчик Коултера, изобретенный Уоллесом Коултером, использует постоянный ток (DC) для подсчета частиц (клеток) и генерирует электрические импульсы, амплитуда которых зависит от размера клеток. Клетки можно рассматривать как электрические изоляторы, окруженные проводящей жидкостью, которая частично блокирует электрическую цепь, временно увеличивая измеренное сопротивление. Это наиболее распространенная измерительная система, основанная на принципе Коултера. Последующие разработки позволили расширить получаемую информацию за счет использования переменного тока (AC) для исследования комплексного электрического импеданса клеток, а не только для подсчета их количества. Клетку можно приблизительно представить как изолирующую клеточную мембрану, окружающую проводящую цитоплазму. Тонкость клеточной мембраны создает электрическую емкость между цитоплазмой и окружающим ее электролитом. Электрический импеданс можно измерять при различных частотах переменного тока. При низких частотах (значительно ниже 1 МГц) импеданс аналогичен сопротивлению постоянному току. Однако более высокие частоты в диапазоне МГц позволяют исследовать толщину клеточной мембраны (которая определяет ее емкость). При гораздо более высоких частотах (значительно выше 10 МГц) импеданс емкости мембраны снижается настолько, что основной вклад в измеренный импеданс вносит сама цитоплазма (мембрана фактически "коротится"). Таким образом, используя разные частоты, прибор может стать чувствительным к внутренней структуре и составу клеток.

Гематология

Наиболее успешным и важным применением счетчика Коултера является характеристика клеток крови человека. Эта методика используется для диагностики широкого спектра заболеваний и является стандартным методом для подсчета эритроцитов (RBC) и лейкоцитов (WBC), а также определения нескольких других распространенных показателей. В сочетании с другими технологиями, такими как флуоресцентная маркировка и рассеяние света, принцип Коултера позволяет получить детальный профиль клеток крови пациента.

Количество и размер клеток

Помимо клинического подсчета клеток крови (диаметр клеток обычно 6–10 микрометров), счетчик Коултера прочно зарекомендовал себя как наиболее надежный лабораторный метод для подсчета широкого спектра клеток, от бактерий (менее 1 микрометра в размере) до жировых клеток (около 400 микрометров), эмбриоидных тел стволовых клеток (около 900 микрометров) и агрегатов растительных клеток (более 1200 микрометров).

Характеристика частиц

Счетчики Coulter широко применялись в различных областях благодаря их способности индивидуально измерять частицы, не завися от их оптических свойств, чувствительности и надежности. Этот принцип был адаптирован для наномасштаба и используется в методах характеризации наночастиц, известных как микрофлюидное резистивное импульсное зондирование, а также в одном коммерческом продукте, который компания называет настраиваемым резистивным импульсным зондированием (TRPS). TRPS обеспечивает высокоточный анализ широкого спектра наночастиц, включая функционализированные наночастицы для доставки лекарств, вирусные частицы (VLP), липосомы, экзосомы, полимерные наночастицы и микропузырьки.