Ник трансляциясы – ДНК-ны белгілеу әдісі. ДНК полимеразасымен ДНК тізбегін ізбестен таңбалау, FISH және блоттинг техникаларында қолданылады. Зерттеуге көмектеседі.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Кіріспе
Ник трансляциясы (немесе бас трансляциясы) – Питер Ригби мен Пол Берг 1977 жылы әзірлеген молекулалық биологиядағы таңбалау әдісі. Бұл әдісте ДНК полимераза I ДНК тізбегінің кейбір нуклеотидтерін ізбестелген аналогтарымен алмастыру үшін қолданылады, нәтижесінде таңбаланған ДНК тізбегі пайда болады, оны флуоресценттік in situ гибридтеу (FISH) немесе блоттеу әдістерінде зонд ретінде қолдануға болады. Оны радиоактивті таңбалау үшін де пайдалануға болады. Бұл процесс ник трансляциясы деп аталады, себебі өңделетін ДНК бір тізбекті "никтер" жасау үшін ДНҚ-азамен өңделеді. Содан кейін ДНК полимераза I кесілген жерлерде 3' гидроксилдік ұшын ұзарта отырып, 5'–3' экзонуклеазалық активтілік арқылы нуклеотидтерді алып тастап, оларды dNTP-ге ауыстырады. Блоттеу процедураларында зонд ретінде қолданылатын ДНК фрагментін радиоактивті таңбалау үшін реакцияда қосылған нуклеотидтердің бірі альфа-фосфат позициясында радиоактивті таңбаланады. Сол сияқты, флуоресценттік таңбалау үшін флюорофорды немесе иммунодетекция үшін антигенді қосуға болады. ДНК полимераза I ДНК-дан ажырағанда фосфат тізбегінде тағы бір "ник" қалдырады. "Ник" полимеразаның процессивтілігіне байланысты белгілі бір қашықтыққа "аударылған". Бұл "никті" ДНК лигазамен жабуға болады немесе оның 3' гидроксил тобы одан әрі ДНК полимераза I активтілігі үшін матрица ретінде қызмет ете алады. Процедураның барлық қадамдарын бір инкубацияда орындау үшін коммерциялық ферменттік қоспалар қолжетімді. Егер ДНК полимераза I қарсы тізбекте басқа "никке" тап болса, ник трансляциясы екі тізбекті ДНК үзілуіне әкелуі мүмкін, нәтижесінде екі қысқа фрагмент пайда болады. Бұл таңбаланған зондтың in situ гибридтеудегі тиімділігіне әсер етпейді.
Nick translation (or head translation), developed in 1977 by Peter Rigby and Paul Berg, is a tagging technique in molecular biology in which DNA Polymerase I is used to replace some of the nucleotides of a DNA sequence with their labeled analogues, creating a tagged DNA sequence which can be used as a probe in fluorescent in situ hybridization (FISH) or blotting techniques. It can also be used for radiolabeling. This process is called nick translation because the DNA to be processed is treated with DNAase to produce single stranded "nicks". This is followed by replacement in nicked sites by DNA polymerase I, which elongates the 3' hydroxyl terminus, removing nucleotides by 5' 3' exonuclease activity, replacing them with dNTPs. To radioactively label a DNA fragment for use as a probe in blotting procedures, one of the incorporated nucleotides provided in the reaction is radiolabeled in the alpha phosphate position. Similarly, a fluorophore can be attached instead for fluorescent labelling, or an antigen for immunodetection. When DNA polymerase I eventually detaches from the DNA, it leaves another nick in the phosphate backbone. The nick has "translated" some distance depending on the processivity of the polymerase. This nick could be sealed by DNA ligase, or its 3' hydroxyl group could serve as the template for further DNA polymerase I activity. Proprietary enzyme mixes are available commercially to perform all steps in the procedure in a single incubation. Nick translation could cause double stranded DNA breaks, if DNA polymerase I encounters another nick on the opposite strand, resulting in two shorter fragments. This does not influence the performance of the labelled probe in in situ hybridization.