Ник-трансляция ДНК: метод мечения нуклеотидов ДНК-полимеразой I для FISH, блоттинга и радиоактивной маркировки. Подробное описание процесса и применения.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Nick translation (или head translation), разработанный в 1977 году Питером Ригби и Полом Бергом, является методом мечения в молекулярной биологии, при котором ДНК-полимераза I используется для замены некоторых нуклеотидов последовательности ДНК на их меченые аналоги, создавая меченую последовательность ДНК, которая может использоваться в качестве зонда в методах флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) или блоттинга. Его также можно использовать для радиоактивного мечения. Этот процесс называется ник-трансляцией, поскольку обрабатываемая ДНК подвергается воздействию ДНКазы для создания одноцепочечных «разрывов» (ников). Затем происходит замещение в местах разрывов ДНК-полимеразой I, которая удлиняет 3'-гидроксильный конец, удаляя нуклеотиды посредством 5'→3'-экзонуклеазной активности и заменяя их dNTP. Для радиоактивного мечения фрагмента ДНК, используемого в качестве зонда в процедурах блоттинга, один из включенных в реакцию нуклеотидов метится радиоактивной меткой в α-фосфатном положении. Аналогично, вместо этого можно присоединить флуорофор для флуоресцентного мечения или антиген для иммунодетекции. Когда ДНК-полимераза I окончательно отсоединяется от ДНК, она оставляет еще один разрыв в фосфатном остове. Ник «сместился» на определенное расстояние в зависимости от процессивности полимеразы. Этот разрыв может быть запечатан ДНК-лигазой, или его 3'-гидроксильная группа может служить матрицей для дальнейшей активности ДНК-полимеразы I. В продаже имеются запатентованные смеси ферментов, позволяющие выполнить все этапы процедуры за один инкубационный период. Ник-трансляция может приводить к разрывам двухцепочечной ДНК, если ДНК-полимераза I встречает другой разрыв на противоположной цепи, что приводит к образованию двух более коротких фрагментов. Это не влияет на эффективность меченого зонда при in situ гибридизации.
Nick translation (or head translation), developed in 1977 by Peter Rigby and Paul Berg, is a tagging technique in molecular biology in which DNA Polymerase I is used to replace some of the nucleotides of a DNA sequence with their labeled analogues, creating a tagged DNA sequence which can be used as a probe in fluorescent in situ hybridization (FISH) or blotting techniques. It can also be used for radiolabeling. This process is called nick translation because the DNA to be processed is treated with DNAase to produce single stranded "nicks". This is followed by replacement in nicked sites by DNA polymerase I, which elongates the 3' hydroxyl terminus, removing nucleotides by 5' 3' exonuclease activity, replacing them with dNTPs. To radioactively label a DNA fragment for use as a probe in blotting procedures, one of the incorporated nucleotides provided in the reaction is radiolabeled in the alpha phosphate position. Similarly, a fluorophore can be attached instead for fluorescent labelling, or an antigen for immunodetection. When DNA polymerase I eventually detaches from the DNA, it leaves another nick in the phosphate backbone. The nick has "translated" some distance depending on the processivity of the polymerase. This nick could be sealed by DNA ligase, or its 3' hydroxyl group could serve as the template for further DNA polymerase I activity. Proprietary enzyme mixes are available commercially to perform all steps in the procedure in a single incubation. Nick translation could cause double stranded DNA breaks, if DNA polymerase I encounters another nick on the opposite strand, resulting in two shorter fragments. This does not influence the performance of the labelled probe in in situ hybridization.