Кіріспе

Иондау техникасы

Массалық спектрометрияда матрицалық көмекпен лазерлік десорбция/иондау (MALDI) – лазерлік энергияны сіңіретін матрицаны пайдаланып, ірі молекулалардан иондарды минималды фрагментация арқылы жасауға арналған иондау техникасы. Ол биомолекулаларды (ДНҚ, ақуыздар, пептидтер және көмірсулар сияқты биополимерлерді) және әртүрлі органикалық молекулаларды (полимерлер, дендримерлер және басқа да макромолекулалар сияқты) талдау үшін қолданылады, олар дәстүрлі иондау әдістерімен иондалғанда көбінесе сынғыш болып келіп, фрагменттерге бөлінеді. Бұл техника электроспрейлік иондау (ESI) сияқты, екеуі де газ фазасында ірі молекулалардың иондарын алудың салыстырмалы түрде жұмсақ (азырақ фрагментация) әдістері болып табылады, бірақ MALDI көбінесе көп зарядталған иондарды аз мөлшерде ғана шығарады. MALDI әдістемесі үш қадамнан тұрады. Біріншіден, сынамаға қолайлы матрицалық материал қосылып, металл пластинаға жағылады. Екіншіден, импульсті лазер сынамаға сәуле шашып, сынама мен матрицалық материалдың абляциясын және десорбциясын тудырады. Соңында, талданатын молекулалар абляцияланған газдардың ыстық ағынында протондалады немесе депротондалады, содан кейін олар талдау үшін қолданылатын массалық спектрометрге жылдамдатылады.

Тарих

Матрицалық көмекпен лазерлік десорбция иондау (MALDI) термині 1985 жылы Франц Хилленкамп, Майкл Карас және олардың әріптестері тарапынан ұсынылды. Бұл зерттеушілер аминқышқылы аланин, триптофанмен араластырылып, 266 нм импульсті лазермен сәулелендірілгенде, оны иондаудың оңай болатынын анықтады. Триптофан лазерлік энергияны сіңіріп алып, аланиннің иондануына көмектесті. Осы "матрица" түрімен араластырылғанда, 2843 Да пептид мелиттинге дейінгі пептидтерді иондауға болады. Ірі молекулалы лазерлік десорбция иондау үшін маңызды жаңалық 1987 жылы Шимадзу корпорациясының Коичи Танака және оның әріптестері "өте ұсақ металл және сұйық матрица әдісі" деп атаған әдісті қолданғанда болды. Бұл әдіс иондау үшін глицериндегі 30 нм кобальт бөлшектерін 337 нм азот лазерімен үйлестірді. Осы лазерлік және матрицалық комбинацияны пайдалана отырып, Танака 34 472 Да карбоксипептидаза А белгісі бар биомолекулаларды иондауға қол жеткізді. Танака лазер толқын ұзындығы мен матрицаның дұрыс таңдалуымен белокты иондауға болатынын көрсеткені үшін 2002 жылғы химия бойынша Нобель сыйлығының төрттен бір бөлігіне ие болды. Карас пен Хилленкамп кейіннен никотин қышқылы матрицасы мен 266 нм лазерді қолдана отырып, 67 кДа альбумин белгісі бар протеиннің иондануын жүзеге асыра алды. 355 нм лазерді және феруль қышқылы, кофе қышқылы және синапин қышқылы сияқты канамик қышқыл туындыларын қолдану арқылы одан әрі жетілдірулер жасалды. Бүгінгі таңда MALDI массалық спектрометриясында көбінесе органикалық матрицалар қолданылады.

Аспаптар

MALDI технологиясының бірнеше түрі бар және қазіргі уақытта осыған ұқсас құралдар әртүрлі мақсаттар үшін өндірілуде, академиялық және талдаулық зерттеулерден бастап, өнеркәсіптік және жоғары өнімділікке дейін. Массалық спектрометрия саласы FT ICR құралдары сияқты өте жоғары ажыратымдылықты массалық спектрометрияны, сондай-ақ жоғары өтімді құралдарды қажет етуге дейін кеңейді. Көптеген MALDI MS құралдарын алмастырылатын иондау көзімен (электроспрей иондау, MALDI, атмосфералық қысым иондау, т.б.) сатып алуға болады, сондықтан технологиялар көбінесе бірімен-бірі тоғысады және көп жағдайда кез келген жұмсақ иондау әдісін қолдануға болады. Жұмсақ иондау әдістерінің тағы да бірнеше түрлері үшін: Жұмсақ лазерлік десорбция немесе ион көзі бөліміне қараңыз.

Лазерлік

MALDI әдістері көбінесе азот лазерлері (337 нм) және үш есе және төрт есе жиілігі өзгертілген Nd:YAG лазерлері (сәйкесінше 355 нм және 266 нм) сияқты ультракөк сәулелі лазерлерді пайдаланады. Инфрақызыл MALDI үшін қолданылатын инфрақызыл лазер толқындарының ұзындығы 2,94 мкм Er:YAG лазерін, орта IR оптикалық параметрлік осцилляторын және 10,6 мкм көмірқышқыл газы лазерін қамтиды. Бұл лазерлер иондалудың жұмсақ түріне байланысты, ультракөк сәулелі лазерлерге қарағанда жиі қолданылмайды. IR MALDI материалды көп мөлшерде жоюдың (биологиялық үлгілер үшін тиімді), төмен молекулалық салмақтың кедергісін азайтудың және матрицасыз лазерлік десорбциялық массалық спектрометрия әдістерімен үйлесімділіктің қосымша артықшылықтарына ие.

Ұшу уақыты

MALDI-де ең көп қолданылатын массалық спектрометр түрі – ұшу уақыты массалық спектрометрі (TOF), негізінен оның кең массалық диапазонына байланысты. TOF өлшеу процедурасы MALDI иондау процесіне де өте ыңғайлы, себебі импульсті лазер үздіксіз жұмыс істемей, жеке-жеке "атулар" жасайды. MALDI TOF құралдары көбінесе рефлектормен ("иондық күзгү") жабдықталады, ол электр өрісін пайдаланып иондарды кері шағылыстырады. Бұл иондардың ұшу жолын ұзартып, әртүрлі m/z мәніне ие иондар арасындағы ұшу уақытын ұлғайтады, соның салдарынан ажыратымдылығы артады. Қазіргі заманғы коммерциялық рефлекторлы TOF құралдары 50,000 FWHM (толық енінің жартысы, Δm – шыңның биіктігінің 50% деңгейіндегі ені ретінде анықталады) немесе одан да жоғары ажыратымдылыққа жетеді. MALDI, фосфорилденген және фосфорилденбеген пептидтерді анықтау үшін IMS TOF MS-пен үйлестірілді. MALDI FT ICR MS жоғары ажыратымдылықты MALDI MS өлшемдері қажет болғанда тиімді әдіс екені дәлелденді.

Атмосфералық қысым

Атмосфералық қысымдағы (АҚ) матрицалық көмекпен лазерлік десорбция/иондау (MALDI) – иондау техникасы (ион көзі), ол вакуумдық MALDI-ден айырмашылығы, қалыпты атмосфералық ортада жұмыс істейді. Вакуумдық MALDI мен АҚ MALDI арасындағы негізгі айырмашылық – иондардың пайда болатын қысымы. Вакуумдық MALDI-де иондар әдетте 10 мТор немесе одан төмен қысымда түзіледі, ал АҚ MALDI-де иондар атмосфералық қысымда пайда болады. Бұрын АҚ MALDI техникасының дәстүрлі вакуумдық MALDI техникасына қарағанда басты кемшілігі – оның сезімталдығының төмен болуы еді; алайда, иондарды массалық спектрометрге жоғары тиімділікпен жіберуге болады және аттомольдік деңгейде анықтау мүмкіндігі туралы хабарламалар бар. АҚ MALDI массалық спектрометрияда (МС) протеомикадан дәрі-дәрмектерді іздеуге дейінгі көптеген қолданыстарда қолданылады. АҚ MALDI массалық спектрометриясымен зерттелетін маңызды тақырыптар: протеомика; ДНК, РНК, ПНА, липидтер, олигосахаридтер, фосфопептидтер, бактериялар, кішкентай молекулалар және синтетикалық полимерлердің массалық талдауы – бұл мүмкіндіктер вакуумдық MALDI құралдарында да бар. АҚ MALDI ион көзін иондық тұзақ массалық спектрометріне немесе электроспрей иондау (ESI) немесе наноESI көзімен жабдықталған кез келген басқа МС жүйесіне оңай қосуға болады. Төмендетілген қысымда иондауды қолданатын MALDI көбінесе бір зарядталған иондарды ғана шығарады (төмендегі «Иондау механизмі» бөлімін қараңыз). Керісінше, атмосфералық қысымда иондау арқасында жоғары зарядталған аналиттер пайда болады, бұл алғашқыда инфрақызыл және кейін азот лазерлері үшін көрсетілген. Аналиттерді көп рет зарядтау өте маңызды, себебі ол төртполярлар сияқты кіші m/z анықтау диапазондарына ие құралдарда, протеиндер сияқты жоғары молекулалық салмақты қосылыстарды өлшеуге мүмкіндік береді. Бұл эффекттің пайда болуы үшін қысымнан басқа, матрицаның құрамы да маңызды.

Аэрозоль

Аэрозольдік масса спектрометрияда иондау әдістерінің бірі лазерді жеке тамшыларға бағыттау болып табылады. Бұл жүйелер бір бөлшектік массалық спектрометрлер (SPMS) деп аталады. Сынаманы аэрозольдеу алдында MALDI матрицасымен қосу мүмкіндігі бар.

Биохимия

Протеомикада MALDI гельдік электрофорезбен оқшауланған белоктарды жылдам анықтау үшін қолданылады: SDS PAGE, мөлшерлік алып тастау хроматографиясы, туыстық хроматография, күшті/әлсіз ион алмасу, изотоптық кодталған белок тегтеу (ICPL) және екі өлшемді гельдік электрофорез. Пептидтік массалық ізге алу MALDI TOF массалық спектрометрлерінің ең көп таралған талдамалық қолданысы болып табылады. MALDI TOF/TOF массалық спектрометрлері пептидтердің аминқышқылдық тізбегін бастапқы ыдырау немесе жоғары энергиялы соқтығысумен туындаған диссоциация арқылы анықтау үшін қолданылады (әрі қарай массалық спектрометрияға қараңыз). MALDI TOF посттрансляциялық модификацияларды сипаттау үшін қолданылған. Мысалы, белоктың метилденуі және деметилденуін зерттеуде кеңінен қолданылған. Дегенмен, MALDI TOF арқылы посттрансляциялық модификацияларды зерттеу кезінде сақтық тану қажет. Мысалы, гликозильденген пептидтерді MALDI MS талдауы үшін дигидроксибензой қышқылы (DHB) матрица ретінде қолданылған кезде сиал қышқылының жоғалуы анықталған жарияланымдар бар. Синапина қышқылы, 4 HCCA және DHB матрицаларын пайдаланып, С. Мартин гликозильденген пептидтердегі сиал қышқылының жоғалуын MALDI/TOF-тағы сызықтық және рефлектор режимдеріндегі метастабильді ыдырау арқылы зерттеді. Shimadzu Corporation тобы сиал қышқылын анықтау сезімталдығын арттыру үшін амидтеу реакциясы арқылы өңдеді, сондай-ақ сиалирленген олигосахаридтерді MALDI/TOF MS талдауы кезінде иондық сұйық матрица сиал қышқылының жоғалуын азайтатынын көрсетті. Гликозильденген пептидтерді MALDI MS-те талдау кезінде сиал қышқылының жоғалуын азайту үшін THAP, DHAP және 2-аза-2-тиотимин мен фенилгидразин қоспасы матрица ретінде сәйкес келеді. Кейбір посттрансляциялық модификациялардың жоғалуын азайту үшін UV MALDI орнына IR MALDI қолдануға болады. MALDI TOF ақуыздардан басқа липидтерді зерттеуде де қолданылған. Мысалы, ол фосфолипазалардың катализдік реакцияларын зерттеуде қолданылған. Липидтерден өзге, олигонуклеотидтер де MALDI TOF арқылы сипатталған. Мысалы, молекулалық биологияда 5-метоксисалицил қышқылы мен спермин қоспасы олигонуклеотидтерді талдау үшін MALDI массалық спектрометриясында, мысалы олигонуклеотидтерді синтездегеннен кейін матрица ретінде қолданылуы мүмкін.

Органикалық химия

Кейбір синтетикалық макромолекулалар, мысалы катенандар мен ротаксандар, дендримерлер мен гипербұтақты полимерлер және басқа да құрастырмалар, молекулалық салмағы мыңдаған немесе он мыңдағанға жетеді, онда көптеген иондау техникалары молекулалық иондарды алуда қиындық тудырады. MALDI – химияшыларға мұндай синтездердің нәтижелерін жылдам талдауға және оларды растауға мүмкіндік беретін қарапайым және жедел талдау әдісі.

Полимерлер

Полимер химиясында MALDI молярлық массаның таралуын анықтау үшін қолданылады. 1,2-ден жоғары полидисперстілігі бар полимерлерді MALDI арқылы сипаттау қиын, өйткені сигналдың қарқындылығы жоғары массалы олигомерлерге қатысты азаяды. Полимерлер үшін жақсы матрица дитранол немесе AgTFA болып табылады. Үлгіні бірінші кезде дитранолмен араластырып, содан кейін AgTFA қосылуы керек; әйтпесе үлгі ерітіндіден шөкпеленеді.

Микробиология

MALDI TOF спектрлері бактериялар немесе саңырауқұлақтар сияқты микроорганизмдерді анықтау үшін жиі қолданылады. Микробтың колониясының бір бөлігі сынамалық нысанаға салынып, матрицамен жабылады. Экспрессияланған ақуыздардың массалық спектрлері арнайы бағдарламалық қамтамасыз ету арқылы талданып, түрлерді анықтау үшін сақталған профильдермен салыстырылады, бұл процеске биотиптеу деп аталады. Бұл әдіс басқа иммунологиялық немесе биохимиялық процедураларға қарағанда артықшылықтар ұсынады және клиникалық микробиологиялық зертханаларда түрлерді анықтаудың кең таралған әдісіне айналды. Фурье түрлендіру иондық циклотрон резонанстық массалық спектрометриясында (FT MS деп те аталады) жоғары ажыратымды MALDI MS жүргізу вирустарды типтеу және субтиптеу үшін, сондай-ақ протеотиптеу деп аталатын бір ионды анықтау арқылы, әсіресе грипп вирустарына қатысты тиімділігі дәлелденді. Басқа микробиологиялық идентификациялау әдістерімен салыстырғандағы басты артықшылығы – микроорганизмдердің кең спектрін оларды оқшаулау үшін қолданылатын селективті ортадан тікелей, төмен құнмен, жылдам және сенімді түрде анықтау мүмкіндігі. Күдікті немесе «болжамды» колонияны тазарту қажеттілігінің жоқтығы нәтижелерді алу уақытын қысқартады. Мысалы, MALDI TOF бактерияларды тікелей қан культураларынан анықтау үшін қолданылуы мүмкін екені көрсетілді. Тағы бір артықшылығы – бактериялардың антибиотиктерге сезімталдығын болжау мүмкіндігі. Бір массалық спектрлік шыңы Staphylococcus aureus-тің метициллинге төзімділігін болжауға болады. MALDI карбапенемге төзімді Enterobacteriaceae, соның ішінде Acinetobacter baumannii және Klebsiella pneumoniae-нің карбапенемазасын анықтай алады. Дегенмен, антибиотиктерге төзімділікті қамтамасыз ететін көптеген ақуыздар MALDI TOF-тың 2000–20 000 Да диапазонынан асып түседі, сондықтан 2011 жылғы NIH-де Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) індеті сияқты жағдайларда ғана шың мен төзімділікті қамтамасыз ететін ақуыз арасындағы байланысты анықтау мүмкін.

Паразитология

MALDI TOF спектрлері трипанозоматидтер, лейшмания және плазмодиум сияқты әртүрлі паразиттерді анықтау және идентификациялау үшін қолданылған. Бұл бір жасушалы паразиттерден өзге, MALDI/TOF құрттар немесе церкариялар сияқты паразиттер жәндіктерді, сондай-ақ трематодалардың еркін жүзу кезеңін анықтау үшін де пайдаланылуы мүмкін.

Медицина

MALDI TOF спектрлері көбінесе ауруларды диагностикалауда басқа талдау және спектроскопия әдістерімен бірге қолданылады. MALDI/TOF – үлкен әлеуеті бар диагностикалық құрал, себебі ол протеиндерді және олардың өзгерістерін жылдам анықтауға мүмкіндік береді, бұл секвенирлеудің құны немесе есептеу қуаты, сондай-ақ рентгендік кристаллографияда кристалл құрылымын шешуге қажетті білік немесе уақытсыз мүмкін. Мысалы, некротизациялық энтероколит (НЭК) – шала туған нәрестелердің ішектеріне әсер ететін қауіпті ауру. НЭК симптомдары сепсис симптомдарына өте ұқсас, сондықтан көптеген нәрестелер диагноз қою мен емдеуді күтіп жүріп қайтыс болады. MALDI/TOF НЭК-позитивті нәрестелердің фекальдық массасындағы бактерияларды анықтау үшін қолданылды. Бұл зерттеу НЭК-ке байланысты фекальдық микробиотаны сипаттауға бағытталған, ал аурудың механизмі қарастырылмады. Осыған ұқсас техника тез диагностикалық құрал ретінде қолданылуы мүмкін деген үміт бар, бұл секвенирлеуді қажет етпейді. MALDI/TOF диагностикалық мүмкіндіктерінің тағы бір мысалы – қатерлі ісіктер саласы. Панкреастың қатерлі ісігі әлі де ең қауіпті және диагностикалау қиын қатерлі ісіктердің бірі болып табылады. Мембраналық протеиндердегі мутациялардың салдарынан жасушалық сигналданудың бұзылуы ұзақ уақыттан бері панкреатикалық қатерлі ісіктің дамуына себеп болады деп саналады. MALDI/TOF панкреатикалық қатерлі ісікпен байланысты мембраналық протеинды анықтау үшін қолданылды және болашақта ерте анықтау әдісі ретінде де қолданылуы мүмкін. MALDI/TOF емдеуді анықтау үшін де, диагноз қою үшін де қолданылуы мүмкін. MALDI/TOF бактериялардың дәрі-дәрмекке, әсіресе β-лактамдарға (пенициллиндер отбасы) төзімділігін анықтау әдісі ретінде қолданылады. MALDI/TOF стандартты антибиотиктерге төзімділікті көрсететін карбапенемазалардың болуын анықтайды. Бұл әдіс бактерияның дәріге төзімді екенін үш сағаттың ішінде анықтауға мүмкіндік береді деп күтілуде. Бұл техника дәрігерлерге бастапқыда күштірек антибиотиктерді тағайындауға көмектеседі.

Белок кешендерін анықтау

Алғашқы байқаулардың нәтижесінде кейбір пептид кешендері MALDI шашырауы және иондалу кезінде сақталып қалуы мүмкін екендігі анықталды, содан кейін MALDI MS қолданып, ірі ақуыз кешендерін зерттеу туралы хабарламалар жарияланды.

Кіші молекулалар

MALDI үлкен макромолекулаларды талдау үшін жиі қолданылатын техника болса да, 1000 Да-дан төмен массасы бар кіші молекулаларды да талдау мүмкін. Кіші молекулалармен жұмыс істеудегі қиындық – матрицалық әсерлерге байланысты сигналдың бұрмалануы, детектордың қанығуы немесе талдау нысанының сигналының әлсіреуі. Бұл матрицалардың өзі кіші молекулалардан тұруынан туындайды. Матрицаны таңдау талдауға жататын молекулаларға тікелей байланысты.