Введение

Техника ионизации

В масс-спектрометрии матрично-лазерная десорбция/ионизация (MALDI) – это техника ионизации, использующая матрицу, поглощающую энергию лазера, для создания ионов из крупных молекул с минимальной фрагментацией. Она применяется для анализа биомолекул (биополимеров, таких как ДНК, белки, пептиды и углеводы) и различных органических молекул (таких как полимеры, дендримеры и другие макромолекулы), которые, как правило, хрупки и фрагментируются при ионизации более традиционными методами. Она схожа по принципу с электрораспылительной ионизацией (ESI), поскольку обе техники являются относительно мягкими (с низкой степенью фрагментации) способами получения ионов крупных молекул в газовой фазе, хотя MALDI обычно производит значительно меньше многозаряженных ионов. Методология MALDI представляет собой трехэтапный процесс. Сначала образец смешивают с подходящим матричным материалом и наносят на металлическую пластину. Затем импульсный лазер облучает образец, вызывая абляцию и десорбцию образца и матричного материала. Наконец, молекулы аналита ионизируются путем протонирования или депротонирования в горячем шлейфе абляционных газов, после чего они могут быть ускорены в масс-спектрометр, используемый для их анализа.

История

Термин матрично-лазерная десорбционная ионизация (MALDI) был предложен в 1985 году Францем Хилленкампом, Майклом Карасом и их коллегами. Эти исследователи обнаружили, что аминокислоту аланин можно ионизировать легче, если смешать её с аминокислотой триптофаном и облучать импульсным лазером с длиной волны 266 нм. Триптофан поглощал энергию лазера и способствовал ионизации не поглощающего аланина. Пептиды, вплоть до пептида мелиттина массой 2843 Да, могли быть ионизированы при смешивании с таким типом "матрицы". Прорыв в лазерной десорбционной ионизации крупных молекул произошел в 1987 году, когда Коичи Танака из корпорации Shimadzu и его соавторы использовали то, что они назвали "ультрадисперсным металло-жидкостным матричным методом", который объединял частицы кобальта размером 30 нм в глицерине с азотным лазером с длиной волны 337 нм для ионизации. Используя эту комбинацию лазера и матрицы, Танака смог ионизировать биомолекулы размером до 34 472 Да, такие как белок карбоксипептидаза А. Танака получил четверть Нобелевской премии по химии 2002 года за то, что продемонстрировал, что при правильном сочетании длины волны лазера и матрицы можно ионизировать белок. Впоследствии Карас и Хилленкамп смогли ионизировать белок альбумин массой 67 кДа, используя никотиновую кислоту в качестве матрицы и лазер с длиной волны 266 нм. Дальнейшие улучшения были достигнуты благодаря использованию лазера с длиной волны 355 нм и производных коричной кислоты – феруловой, кофеиновой и синапиновой кислот – в качестве матрицы. Сегодня для MALDI масс-спектрометрии в основном используются органические матрицы.

Инструментовка

Существует несколько вариантов технологии MALDI, и сопоставимые приборы сегодня производятся для самых разных целей – от академических и аналитических до промышленных и высокопроизводительных. Область масс-спектрометрии расширилась, включив в себя потребность в масс-спектрометрии ультравысокого разрешения, например, приборы FT ICR, а также в более высокопроизводительных приборах. Поскольку многие приборы MALDI MS можно приобрести с взаимозаменяемым источником ионизации (электрораспыление, MALDI, ионизация атмосферным давлением и т.д.), эти технологии часто пересекаются, и зачастую любой метод мягкой ионизации может быть потенциально использован. Подробнее о различных методах мягкой ионизации см. статьи «Мягкая лазерная десорбция» или «Источник ионов».

Лазерный

Методы MALDI обычно используют ультрафиолетовые лазеры, такие как азотные лазеры (337 нм) и лазеры Nd:YAG с утроенной и учетверенной частотой (355 нм и 266 нм соответственно). Инфракрасные лазерные длины волн, используемые для инфракрасного MALDI, включают Er:YAG лазер с длиной волны 2,94 мкм, среднеинфракрасный оптический параметрический осциллятор и углекислый лазер с длиной волны 10,6 мкм. Хотя и не так распространены, инфракрасные лазеры используются благодаря более мягкому механизму ионизации. IR MALDI также обладает преимуществами в виде более эффективного удаления материала (что полезно для биологических образцов), меньшего количества помех от низкомолекулярных веществ и совместимости с другими методами масс-спектрометрии лазерной десорбции без использования матрицы.

Время полета

Тип масс-спектрометра, наиболее широко используемый с MALDI, – масс-спектрометр с временем пролета (TOF), главным образом благодаря его широкому диапазону масс. Процедура измерения TOF также идеально подходит для процесса ионизации MALDI, поскольку импульсный лазер делает отдельные импульсы, а не работает в непрерывном режиме. Масс-спектрометры MALDI TOF часто оснащаются рефлектроном («ионным зеркалом»), который отражает ионы с помощью электрического поля. Это увеличивает путь пролета ионов, тем самым увеличивая разницу во времени пролета между ионами с разным отношением массы к заряду (m/z) и повышая разрешение. Современные коммерческие рефлекторные масс-спектрометры TOF достигают разрешающей способности m/Δm 50 000 FWHM (полной ширины на полувысоте, Δm определяется как ширина пика на 50% от максимальной высоты пика) и более. MALDI был соединен с IMS TOF MS для идентификации фосфорилированных и нефосфорилированных пептидов. MALDI FT ICR MS показал себя полезным методом, когда требуются высокоразрешающие измерения MALDI MS.

Атмосферное давление

Атмосферное давление (AP) матрично-лазерная десорбция/ионизация (MALDI) – это метод ионизации (ионный источник), который, в отличие от вакуумного MALDI, работает в нормальной атмосферной среде. Основное различие между вакуумным MALDI и AP MALDI заключается в давлении, при котором создаются ионы. В вакуумном MALDI ионы обычно образуются при 10 мТорр или ниже, в то время как в AP MALDI ионы формируются при атмосферном давлении. Ранее основным недостатком метода AP MALDI по сравнению с традиционным вакуумным MALDI была его ограниченная чувствительность; однако ионы могут быть эффективно переданы в масс-спектрометр, и сообщалось о пределах обнаружения в аттомолях. AP MALDI используется в масс-спектрометрии (МС) в широком спектре приложений, от протеомики до разработки лекарственных препаратов. К популярным областям применения масс-спектрометрии AP MALDI относятся: протеомика; анализ масс ДНК, РНК, ПНА, липидов, олигосахаридов, фосфопептидов, бактерий, малых молекул и синтетических полимеров – аналогичные приложения доступны и для вакуумных приборов MALDI. Ионный источник AP MALDI легко сочетается с ионно-ловушечным масс-спектрометром или любой другой МС-системой, оснащенной источником электрораспыления (ESI) или nanoESI. Известно, что MALDI с ионизацией при пониженном давлении производит преимущественно однозарядные ионы (см. раздел "Механизм ионизации" ниже). В отличие от этого, ионизация при атмосферном давлении может генерировать аналиты с высокой степенью заряженности, что было впервые показано для инфракрасных, а затем и для азотных лазеров. Множественное заряжение аналитов имеет большое значение, поскольку позволяет измерять соединения с высокой молекулярной массой, такие как белки, в приборах, обеспечивающих ограниченный диапазон обнаружения m/z, например, квадруполях. Помимо давления, состав матрицы также важен для достижения этого эффекта.

Аэрозоль

В аэрозольной масс-спектрометрии один из методов ионизации заключается в воздействии лазера на отдельные капли. Эти системы называются масс-спектрометрами отдельных частиц (SPMS). Образец может быть опционально смешан с матрицей MALDI перед образованием аэрозоля.

Биохимия

В протеомике MALDI используется для быстрой идентификации белков, выделенных с помощью гелевого электрофореза: SDS PAGE, гель-фильтрация (хроматография исключения размера), аффинная хроматография, ионный обмен (сильный/слабый), маркировка белков кодированием изотопов (ICPL) и двумерный гелевый электрофорез. Пептидный масс-спектрометрический анализ (пептидное массовое картирование) является наиболее распространенным аналитическим применением масс-спектрометров MALDI TOF. Масс-спектрометры MALDI TOF/TOF используются для определения аминокислотной последовательности пептидов с использованием распада после источника или высокоэнергетической диссоциации при столкновении (подробнее см. в разделе «Масс-спектрометрия»). MALDI TOF применялся для характеристики посттрансляционных модификаций. Например, он широко используется для изучения метилирования и деметилирования белков. Однако при изучении посттрансляционных модификаций с помощью MALDI TOF необходимо соблюдать осторожность. Например, в публикациях сообщалось о выявлении потери сиаловой кислоты при использовании дигидроксибензойной кислоты (DHB) в качестве матрицы для MALDI MS-анализа гликозилированных пептидов. S. Martin, используя синапиновую кислоту, 4 HCCA и DHB в качестве матриц, исследовал потерю сиаловой кислоты в гликозилированных пептидах посредством метастабильного распада в MALDI/TOF в линейном и рефлекторном режимах. Группа исследователей из Shimadzu Corporation модифицировала сиаловую кислоту реакцией амидирования для повышения чувствительности обнаружения и показала, что использование ионной жидкости в качестве матрицы снижает потерю сиаловой кислоты при MALDI/TOF MS-анализе сиалированных олигосахаридов. THAP, DHAP и смесь 2-аза-2-тиотимина и фенилгидразина были идентифицированы как матрицы, которые можно использовать для минимизации потери сиаловой кислоты при MALDI MS-анализе гликозилированных пептидов. Сообщалось, что снижение потери некоторых посттрансляционных модификаций возможно при использовании IR MALDI вместо UV MALDI. Помимо белков, MALDI TOF также применяется для изучения липидов. Например, он используется для изучения каталитических реакций фосфолипаз. Кроме липидов, олигонуклеотиды также характеризуются с помощью MALDI TOF. Например, в молекулярной биологии смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина может использоваться в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в MALDI масс-спектрометрии, например, после синтеза олигонуклеотидов.

Органическая химия

Некоторые синтетические макромолекулы, такие как катенены и ротаксаны, дендримеры и гиперразветвленные полимеры, а также другие супрамолекулярные структуры, имеют молекулярные массы, достигающие тысяч или десятков тысяч, при которых большинству методов ионизации сложно генерировать молекулярные ионы. MALDI – это простой и быстрый аналитический метод, позволяющий химикам оперативно анализировать результаты подобных синтезов и подтверждать полученные данные.

Полимеры

В полимерной химии MALDI может быть использован для определения распределения молярных масс. Полимеры с полидисперсностью выше 1,2 сложно характеризовать методом MALDI из-за подавления сигнала от олигомеров с большей массой. Хорошей матрицей для полимеров является дитранол или AgTFA. Сначала образец необходимо смешать с дитранолом, а затем добавить AgTFA, иначе образец выпадет в осадок из раствора.

Микробиология

Спектры MALDI TOF часто используются для идентификации микроорганизмов, таких как бактерии или грибы. Часть колонии исследуемого микроба помещается на мишень для образца и покрывается матрицей. Масс-спектры экспрессированных белков анализируются специализированным программным обеспечением и сравниваются с хранящимися профилями для определения вида, что известно как биотипирование. Этот метод имеет преимущества перед другими иммунологическими или биохимическими процедурами и стал распространенным способом идентификации видов в клинических микробиологических лабораториях. Преимущества MALDI MS высокого разрешения, выполняемого на фурье-трансформационном ионно-циклотронном резонансном масс-спектрометре (также известном как FT MS), продемонстрированы для типирования и субтипирования вирусов посредством одноионного детектирования, известного как протеотипирование, с особым акцентом на вирусы гриппа. Одним из основных преимуществ по сравнению с другими методами микробиологической идентификации является его способность быстро, надежно и недорого идентифицировать широкий спектр микроорганизмов непосредственно из селективной среды, используемой для их выделения. Отсутствие необходимости очистки подозрительной или "предварительной" колонии позволяет значительно сократить время получения результатов. Например, было показано, что MALDI TOF можно использовать для обнаружения бактерий непосредственно из гемокультур. Другим преимуществом является возможность прогнозирования чувствительности бактерий к антибиотикам. Один пик масс-спектра может предсказать устойчивость Staphylococcus aureus к метициллину. MALDI также может обнаруживать карбапенемазы карбапенемустойчивых энтеробактерий, включая Acinetobacter baumannii и Klebsiella pneumoniae. Однако большинство белков, опосредующих устойчивость к антибиотикам, имеют размер больше, чем диапазон 2000–20 000 Да, используемый MALDI TOF для интерпретации пиков белков, и лишь изредка, как в случае вспышки Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) в NIH в 2011 году, можно установить корреляцию между пиком и белком, обуславливающим устойчивость.

Паразитология

Спектры MALDI TOF использовались для обнаружения и идентификации различных паразитов, таких как трипанозоматиды, лейшмании и плазмодии. Помимо этих одноклеточных паразитов, MALDI/TOF может быть использован для идентификации паразитических насекомых, таких как вши или церкарии – свободноплавающие стадии трематод.

Медицина

Спектры MALDI TOF часто используются в сочетании с другими методами анализа и спектроскопии в диагностике заболеваний. MALDI/TOF – это диагностический инструмент с большим потенциалом, поскольку он позволяет быстро идентифицировать белки и изменения в белках без затрат и вычислительных ресурсов, необходимых для секвенирования, а также без специальных навыков и времени, требуемых для определения кристаллической структуры методом рентгеновской кристаллографии. Одним из примеров является некротизирующий энтероколит (НЭК) – тяжелое заболевание, поражающее кишечник недоношенных детей. Симптомы НЭК очень похожи на симптомы сепсиса, и многие младенцы умирают в ожидании диагностики и лечения. MALDI/TOF был использован для идентификации бактерий, присутствующих в фекальных массах младенцев с диагностированным НЭК. Данное исследование было сосредоточено на характеристике фекальной микробиоты, связанной с НЭК, и не рассматривало механизм развития заболевания. Есть надежда, что подобная методика может быть использована в качестве быстрого диагностического инструмента, не требующего секвенирования. Другим примером диагностической мощи MALDI/TOF является область онкологии. Рак поджелудочной железы остается одним из самых смертоносных и трудно диагностируемых видов рака. Нарушение клеточной сигнализации из-за мутаций в мембранных белках давно подозревается в участии в развитии рака поджелудочной железы. MALDI/TOF был использован для идентификации мембранного белка, связанного с раком поджелудочной железы, и в перспективе может даже служить методом раннего выявления. MALDI/TOF также потенциально может использоваться для определения тактики лечения, помимо диагностики. MALDI/TOF служит методом определения лекарственной устойчивости бактерий, особенно к β-лактамам (семейству пенициллинов). MALDI/TOF обнаруживает наличие карбапенемаз, что свидетельствует о лекарственной устойчивости к стандартным антибиотикам. Предполагается, что это может стать методом идентификации бактерий, устойчивых к лекарственным препаратам, всего за три часа. Эта методика может помочь врачам принять решение о назначении более агрессивных антибиотиков на начальном этапе лечения.

Обнаружение белковых комплексов

После первоначальных наблюдений о том, что некоторые комплексы пептидов могут сохраняться при нанесении и ионизации методом MALDI, были опубликованы исследования крупных белковых комплексов с использованием MALDI MS.

Малые молекулы

Хотя MALDI является распространенным методом для анализа крупных макромолекул, часто возможно анализировать и небольшие молекулы с массой менее 1000 Да. Проблема с малыми молекулами заключается в эффектах матрицы, когда возможно возникновение помех сигналу, насыщение детектора или подавление сигнала анализируемого вещества, поскольку сами матрицы часто состоят из малых молекул. Выбор матрицы сильно зависит от того, какие молекулы предстоит анализировать.