Зебрабалық AB9 жасушаларының өсірілуі және қолданылуы
Zebrafish AB9 cell line
Зебрабалық AB9 жасушалары: зерттеулер үшін маңызды модель. Биохимия, даму, генетика және жаңару салаларында қолданылады. Өсіру шарттары мен ерекшеліктері.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Зебрабалық AB9 жасушалары – AB штаммының қанатты тінінен алынған біріншілік фибробласт жасушалар желісі. Бұл жасушалар зебрабалықтың биохимиялық және молекулалық қасиеттерін зерттеу үшін жиі қолданылады. Жасушалар Dulbecco-ның модификацияланған Eagle's ортасында (DMEM), 15% ұлпалық сиыр сарысуымен (FBS) толықтырылып, 28°C температурада, ылғалды және 5% CO2 қосылған атмосферада өсіріледі. Мұндай жағдайда, жаңа өсіру ортасымен 3 күндік интервалмен қоректендірілгенде, жасушалар әр 72 сағат сайын 4-ке бөлінеді.
Zebrafish AB9 cells are a primary fibroblast cell line developed from fin tissue of the AB strain. These cells are commonly used for studies focusing on the biochemical and molecular properties of zebrafish. Cells are grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS) in a humid, 5% CO2 enriched atmosphere at 28 °C. Under these conditions, cells passaged 1 in 4 doubled every 72 hours when fed with fresh culture medium at 3 day intervals.
Балықтардың негізгі эмбрионалды фибробласты жасушаларының өсірілуі
Зебра балығы маңызды омыртқалы жануар болып табылады және генетика, даму биологиясы, химиялық биология және регенерация салаларында маңызды модель ретінде пайда болды. Клеткалық мәдениетті құру үшін 200-300 Аb штаммдық зебра балығының эмбриондары, 5-10 сомит сатысында, 300 мкл/мл протеазамен өңделіп хлордан тазартылды және ПБС-пен шайылып алынды. Содан кейін, 2 минут бойы ПБС-те 1:400 қатынасында сұйылтылып, 0,05% трипсин/EDTA қосып ұсақ бөліктерге бөлініп, 25 см² Collagen I Biocoated колбаға егілді. Жасушалар ДМЭМ негізіндегі ортада өсірілді. Орта 25 нг/мл адам эпидермалды өсу факторымен толықтырылды. Екінші өтімнен кейін, жасушалар EGF және bbFGF қоспағанда, алғашқысымен ұқсас ортада қайта өсірілді. Зевра балығының алғашқы эмбрионалды фибробластары, ZEF1 және ZEF2, трансфекцияға дейін екі және үш ай бойы 29°C және 5% ылғалдылықта сақталды.
Zebrafish is an important vertebrate and emerged as an important model for genetics, developmental biology, chemical biology, and regeneration. In order to establish cell culture about 200 300 zebrafish Ab strain embryos at 5 10 somite stage were dechlorinated by 300 ul/mL protease treatment and washed with PBS. Followed by dilution in 1:400 in PBS for 2 minutes and broken up into small parts with 0.05% trypsin/EDTA and plated on 25 cm^2 Collagen I Biocoated flask. Cells were cultured in a medium composed of DMEM. The medium is further enriched with 25 ng/ml human epidermal growth factor. After the second passage, cells were cultured again in a medium similar to the first with the exclusion EGF and bbFGF. Primary zebrafish embryonic fibroblasts, ZEF1 and ZEF2 were maintained at 29C and 5% for two and three months before transfection.
АБ9 жасушалары бойынша иммунофлюоресценция
АБ9 жасушалары 5% концентрацияда 28°C температурада инкубацияланды және 15% жылумен инактивацияланған FBS және антибиотиктер-антимикотиктер қосылған минималды орта (DMEM) бар тінді культуралық ыдыстарда өсірілді. Жасушалар поли-L-лизиндік шыныға жайылды және 80-90% конфлюенцияға жеткізілді. Содан кейін олар суық PBS-пен жуылып, 30 минут бөлме температурасында PBS-тегі 4% параформальдегид ерітіндісінде суспензияланды. 30 минут өткен соң жасушалар 1X PBS-пен үш рет, әр реті 5 минуттан жуылды. 0,2% тритонмен PBS-те 10 минут бойы жасуша мембранасы тесілді. Содан кейін 1X PBS-пен бірнеше рет жуылып, 1% BSA-мен PBS-те бөлме температурасында 1 сағат бойы блоктау жүргізілді. Түн бойы қалдырылып, келесі күні жасушалар 1X PBS-пен үш рет, әр реті 5 минуттан жуылды. Жасушаларды жуғаннан кейін, бөлме температурасында 1 сағат бойы екінші антиденемен инкубацияланды, үлгіні кез келген жарықтан қорғап. Одан кейін 1X PBS-пен үш рет 5 минуттан жуу және dH2O-мен шапшаң жуу жүргізілді. АБ9 жасушалары Vectashield-пен бекітілді және Nikon Eclipse TE2000 U микроскопымен 60X үлкейтуде қарастырылды.
AB9 cells were incubated at 5% at 28 C and grown in tissue culture dishes with minimal essential media (DMEM) supplemented with 15% heat inactivated FBS and antibiotics antimycotics. The cells were then placed poly L lysine coverglass and allowing it to grow to 80 90% confluency. Afterwards, they were washed with cold PBS and suspended in a solution of 4% paraformaldehyde in PBS for 30 minutes at room temperature. After 30 minutes have passed we once again wash the cells with 1X PBS, three times for five minutes. We will puncture the cell membrane with 0.2% triton in PBS for 10 minutes. Followed with multiple washes of 1X PBS and blocked in room temperature for one hour in 1% BSA in PBS. We let it sit overnight, and the next day the cells were washed with 1X PBS three time for five minutes each. After washing the cells we incubate with secondary antibody for one hour at room temperature, protecting our sample from any light source. It was followed with an additional three washes for five minutes of 1X PBS and a quick wash of dH2O. The AB9 cells were mounted with vectashield and were examined under Nikon Eclipse TE2000 U at 60X.
АБ9 жасушаларындағы функционалдық сынақтар
Ақуызды жою – организмнің гендерінің азаюын білдіреді. AB9 ақуызын жою үшін, алдымен электропорацияның МО немесе антисенс морфолиноларды сіңірудің сенімді әдісі екенін тексеру қажет. Біз cx43 MO-мен белгіленген флуоресцеинді AB9 жасушаларына электропорация жасаудан бастаймыз, стандартты бақылау MO-ны бақылау ретінде пайдаланамыз. 50-70% тиімділік байқалды. Содан кейін, ақуыз жою арқылы AB9 жасушаларының МО сіңіруін тексереміз. 25 сағаттан кейін стандартты қисық және cx43 Mo өңделген жасушалардан лизаттар дайындалды. Келесі қадамда, AB9 жасушаларын фармакологиялық заттармен емдеу арқылы ақуыздың қызметін тоқтатуға болатынын анықтауға тырысамыз. Бұл жағдайда ингибитор Hsp47 болады және жасушаны 100 мкМ ингибитормен емдейміз, DMSO бақылау ретінде қолданылады.
Knocking down a protein mean that an organism's genes are reduced. To knockdown AB9 the first thing that is test is if electroporation is a reliable method for uptake of MO or antisense morpholinos. We begin by electrophoralting fluorescein labeled cx43 MO into AB9 cells, using fluorescein labeled standard control MO as the control. We observe that the efficiency of 50 70%. Next we test the MO uptake of AB9 led by protein knockdown. Lysates were prepared from Standard curve and cx43 Mo treated cells at 25 hpe. Next, we try to determine if we can block protein function by treating AB9 with pharmacological agents. The inhibitor in this case will be Hsp47 and we treat the cell with 100 um of the inhibitor, using DMSO control.