Введение
Клетки AB9, полученные из рыбы-зебры, — это первичная клеточная линия фибробластов, разработанная из ткани плавников штамма AB. Эти клетки широко используются в исследованиях, направленных на изучение биохимических и молекулярных свойств рыбы-зебры. Клетки культивируют в среде DMEM (модифицированная среда Игла) компании Dulbecco, дополненной 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS) во влажной атмосфере, обогащенной 5% CO2, при 28 °C. В этих условиях клетки, прошедшие первое из четырех делений, удваиваются каждые 72 часа при замене среды культивирования каждые 3 дня.
Клетки первичной эмбриональной фибробластной культуры рыбы-зебры
Рыба-зебра является важным позвоночным и стала важной моделью для генетики, биологии развития, химической биологии и регенерации. Для получения клеточной культуры использовали около 200-300 эмбрионов штамма Ab рыбы-зебры на стадии 5-10 сомитов, которые дехлорировали обработкой протеазой в концентрации 300 мкл/мл и промыли PBS. Затем их разбавляли в PBS в соотношении 1:400 на 2 минуты, измельчали до мелких фрагментов с помощью 0,05% трипсина/EDTA и высевали в колбу объемом 25 см² с биопокрытием из коллагена I. Клетки культивировали в среде на основе DMEM, дополнительно обогащенной 25 нг/мл человеческим эпидермальным фактором роста. После второго пассажа клетки вновь культивировали в среде, аналогичной первой, но без добавления EGF и bbFGF. Первичные эмбриональные фибробласты рыбы-зебры ZEF1 и ZEF2 поддерживали при 29°C и 5% в течение двух и трех месяцев перед трансфекцией.
Иммунофлуоресценция на клетках AB9
Клетки AB9 инкубировали в атмосфере с 5% CO₂ при 28 °C и выращивали в чашках Петри для культивирования тканей в минимальной питательной среде (DMEM), дополненной 15% инактивированной на тепле FBS и антибиотиками/антимикотиками. Затем клетки помещали на покровные стекла, покрытые поли-L-лизином, и давали им вырасти до 80-90% конфлюентности. После этого их промывали холодным PBS и суспендировали в 4% растворе параформальдегида в PBS на 30 минут при комнатной температуре. По истечении 30 минут клетки снова промывали раствором 1X PBS три раза по пять минут. Клеточную мембрану пермеабилизировали 0,2% тритоном в PBS в течение 10 минут. Затем клетки многократно промывали раствором 1X PBS и блокировали при комнатной температуре в течение одного часа в 1% BSA в PBS. Образец оставляли на ночь, а на следующий день клетки промывали раствором 1X PBS три раза по пять минут. После промывки клеток их инкубировали со вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре, защищая образец от любого источника света. Далее проводили еще три промывки раствором 1X PBS по пять минут и быструю промывку дистиллированной водой (dH₂O). Клетки AB9 монтировали в Vectashield и исследовали под микроскопом Nikon Eclipse TE2000 U при увеличении 60X.
Функциональные испытания в клетках AB9
Подавление экспрессии белка означает снижение уровня экспрессии генов организма. Для подавления экспрессии AB9 первым делом необходимо проверить, является ли электропорация надежным методом для доставки MO или антисмысловых морфолинов. Мы начинаем с электропорации клеток AB9 морфолином cx43, меченным флуоресцеином, используя стандартный контрольный морфолин, меченный флуоресцеином, в качестве контроля. Мы наблюдаем эффективность в пределах 50-70%. Далее мы проверяем поглощение морфолинов клетками AB9 в условиях подавления экспрессии белка. Лизаты были получены из клеток, обработанных по стандартной кривой и морфолином cx43 Mo через 25 часов после электропорации. Затем мы пытаемся определить, можно ли блокировать функцию белка, обрабатывая клетки AB9 фармакологическими агентами. В данном случае ингибитором будет Hsp47, и мы обрабатываем клетки 100 мкМ ингибитора, используя контроль с ДМСО.