ДНҚ көшірілімінің қатесін түзететін жүйе

Кіріспе

ДНҚ репликациясының негізгі қателерін түзету жүйесі

ДНҚ сәйкессіздіктерін жөндеу (MMR) – ДНҚ репликациясы және рекомбинациясы кезінде туындауы мүмкін негіздердің қате енгізілуін, жойылуын және дұрыс емес қосылуын тану және жөндеу, сондай-ақ ДНҚ зақымдануының кейбір түрлерін жөндеуге арналған жүйе. Сәйкессіздіктерді жөндеу тізбекке тәуелді. ДНҚ синтезі кезінде жаңа синтезделген (қызыл) тізбекте қателер жиі кездеседі. Жөндеуді бастау үшін, сәйкессіздікті жөндеу механизмі жаңа синтезделген тізбекті үлгі (аналық) тізбектен ажыратады. Грам-теріс бактерияларда, өтпелі гемиметилдену тізбектерді ажыратады (аналық тізбек метилденген, ал қызыл тізбек емес). Дегенмен, басқа прокариоттар мен эукариоттарда нақты механизм әлі анықталмаған. Эукариоттарда, жаңа синтезделген кешіккен ДНК тізбегінде (ДНК лигазамен біріктірілгенге дейін) уақытша үзілістер болады деп күдіктенеді, және бұл үзілістер сәйкессіздікті түзету жүйелерін тиісті тізбекке бағыттайтын сигнал береді. Бұл үзілістер алдыңғы тізбекте болуы керек, және соңғы зерттеулер осыны растады. Жақында жүргізілген жұмыстар көрсеткендей, үзілістер репликациялық жылдамдық қысқышын, көбейетін жасушалық ядролық антигенді (PCNA) RFC-ге тәуелді түрде жүктеу орындары болып табылады, сонда пончик пішіндес белоктың бір жағы 3' OH ұшына қарай орналасады. Жүктелген PCNA, MutSalpha немесе MutSbeta қатысуымен сәйкессіздік болғанда MutLalpha эндонуклеазасының әрекетін қызыл тізбекке бағыттайды. ДНҚ-ның суперспиральді құрылымын бұзатын кез келген мутациялық оқиға жасушаның генетикалық тұрақтылығына қауіп төндіреді. Зақымды анықтау және жөндеу жүйелерінің күрделілігі репликация механизмімен салыстырылатындығы, эволюцияның ДНҚ-ның дұрыстығына қаншалықты мән бергенін көрсетеді. Сәйкес келмейтін негіздердің мысалдарына G/T немесе A/C жұптасуы жатады (ДНҚ жөндеуін қараңыз). Сәйкессіздіктер көбінесе ДНҚ репликациясы кезінде негіздердің таутомерленуіне байланысты туындайды. Зақымды сәйкессіздікке байланысты деформацияны тану, үлгілік және үлгілік емес тізбектерді анықтау, қате енгізілген негізді алып тастау және оны дұрыс нуклеотидпен алмастыру арқылы жөндеуге болады. Алып тастау процесі тек сәйкес келмейтін нуклеотидті ғана емес, сонымен қатар жаңа синтезделген ДНК тізбегінің бірнеше немесе мыңдаған негіз жұптарын қамтиды.

DNA mismatch repair (MMR) is a system for recognizing and repairing erroneous insertion, deletion, and mis incorporation of bases that can arise during DNA replication and recombination, as well as repairing some forms of DNA damage. Mismatch repair is strand specific. During DNA synthesis the newly synthesised (daughter) strand will commonly include errors. In order to begin repair, the mismatch repair machinery distinguishes the newly synthesised strand from the template (parental). In gram negative bacteria, transient hemimethylation distinguishes the strands (the parental is methylated and daughter is not). However, in other prokaryotes and eukaryotes, the exact mechanism is not clear. It is suspected that, in eukaryotes, newly synthesized lagging strand DNA transiently contains nicks (before being sealed by DNA ligase) and provides a signal that directs mismatch proofreading systems to the appropriate strand. This implies that these nicks must be present in the leading strand, and evidence for this has recently been found. Recent work has shown that nicks are sites for RFC dependent loading of the replication sliding clamp, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), in an orientation specific manner, such that one face of the donut shape protein is juxtaposed toward the 3' OH end at the nick. Loaded PCNA then directs the action of the MutLalpha endonuclease to the daughter strand in the presence of a mismatch and MutSalpha or MutSbeta. Any mutational event that disrupts the superhelical structure of DNA carries with it the potential to compromise the genetic stability of a cell. The fact that the damage detection and repair systems are as complex as the replication machinery itself highlights the importance evolution has attached to DNA fidelity. Examples of mismatched bases include a G/T or A/C pairing (see DNA repair). Mismatches are commonly due to tautomerization of bases during DNA replication. The damage is repaired by recognition of the deformity caused by the mismatch, determining the template and non template strand, and excising the wrongly incorporated base and replacing it with the correct nucleotide. The removal process involves more than just the mismatched nucleotide itself. A few or up to thousands of base pairs of the newly synthesized DNA strand can be removed.

Қателіктерді қалпына келтіру ақуыздары

Қатесіз жөндеу – прокариоттардан эукариоттарға дейінгі жоғары сақталған процесс. Қатесіз жөндеудің алғашқы дәлелі *S. pneumoniae* (hexA және hexB гендері) арқылы алынды. *E. coli* бойынша жасалған келесі зерттеулер мутациялық түрде белсенділігі жойылғанда гипермутациялық штаммдарды тудыратын бірнеше гендерді анықтады. Сондықтан, ген өнімдері «Mut» ақуыздары деп аталады және қатесіз жөндеу жүйесінің негізгі белсенді компоненттері болып табылады. Осы үш ақуыз қатесіздікті анықтау және жөндеу механизмін оған бағыттау үшін маңызды: MutS, MutH және MutL (MutS – HexA гомологы, ал MutL – HexB гомологы). MutS димер (MutS2) құрайды, ол қыздық тізбектегі қате негізді таниды және мутацияланған ДНК-ға байланысады. MutH еншілес ДНК бойындағы гемиметилденген орындармен байланысады, бірақ оның әрекеті жасырын, MutL димерімен (MutL2) байланысқанда ғана белсендіріледі, ол MutS ДНК кешенімен байланысып, MutS2 мен MutH арасында делдалдық қызмет атқарады және соңғысын белсендіреді. ДНК 1 кб-ға дейін қашықтықтағы қатесіздікке жақын d(GATC) метилирлеу орнын іздеу үшін ілмектейді. MutS ДНК кешенімен белсендірілген кезде MutH гемиметилденген орынның жанындағы қыздық тізбекті кесіп алады. MutL UvrD геликазасын (ДНК геликаза II) 3'-ден 5'-ге дейінгі бағытта екі тізбекті бөлу үшін тартады. Содан кейін MutSHL кешені ДНК бойымен қатесіздік бағытында жылжиды, кесіліп шығарылатын тізбекті босатады. Экзонуклеаза кешенді іздейді және бір тізбекті ДНК құйрығын қорытады. Қай экзонуклеаза тартатылуы MutH тізбекті қай жағынан кесіп алатынына байланысты: 5' немесе 3'. Егер MutH жасаған кесік қатесіздіктің 5' жағында болса, RecJ немесе ExoVII (екі 5'-ден 3'-ге дейінгі экзонуклеазалар) қолданылады. Егер кесік 3' жағында болса, онда ExoI (3'-ден 5'-ге дейінгі фермент) қолданылады. Бүкіл процесс қатесіздік орнынан кейін аяқталады, яғни, оның өзі де, оны қоршаған нуклеотидтер де толықтай кесіліп шығарылады. Экзонуклеазамен құрылған бір тізбекті бос орын ДНК полимераза III (бір тізбекті байланыстырушы ақуыздың көмегімен) арқылы қалпына келтіріледі, ол екінші тізбекті үлгі ретінде пайдаланады, содан кейін ДНК лигазамен біріктіріледі. ДНК метилазасы кейіннен қыздық тізбекті жылдам метилирлейді.

Mismatch repair is a highly conserved process from prokaryotes to eukaryotes. The first evidence for mismatch repair was obtained from S. pneumoniae (the hexA and hexB genes). Subsequent work on E. coli has identified a number of genes that, when mutationally inactivated, cause hypermutable strains. The gene products are, therefore, called the "Mut" proteins, and are the major active components of the mismatch repair system. Three of these proteins are essential in detecting the mismatch and directing repair machinery to it: MutS, MutH and MutL (MutS is a homologue of HexA and MutL of HexB). MutS forms a dimer (MutS2) that recognises the mismatched base on the daughter strand and binds the mutated DNA. MutH binds at hemimethylated sites along the daughter DNA, but its action is latent, being activated only upon contact by a MutL dimer (MutL2), which binds the MutS DNA complex and acts as a mediator between MutS2 and MutH, activating the latter. The DNA is looped out to search for the nearest d(GATC) methylation site to the mismatch, which could be up to 1 kb away. Upon activation by the MutS DNA complex, MutH nicks the daughter strand near the hemimethylated site. MutL recruits UvrD helicase (DNA Helicase II) to separate the two strands with a specific 3' to 5' polarity. The entire MutSHL complex then slides along the DNA in the direction of the mismatch, liberating the strand to be excised as it goes. An exonuclease trails the complex and digests the ss DNA tail. The exonuclease recruited is dependent on which side of the mismatch MutH incises the strand – 5' or 3'. If the nick made by MutH is on the 5' end of the mismatch, either RecJ or ExoVII (both 5' to 3' exonucleases) is used. If, however, the nick is on the 3' end of the mismatch, ExoI (a 3' to 5' enzyme) is used. The entire process ends past the mismatch site i. e., both the site itself and its surrounding nucleotides are fully excised. The single strand gap created by the exonuclease can then be repaired by DNA Polymerase III (assisted by single strand binding protein), which uses the other strand as a template, and finally sealed by DNA ligase. DNA methylase then rapidly methylates the daughter strand.

MutS гомологтары

Байланысқан кезде MutS2 димері ДНК спиралін иеді және шамамен 20 негіз жұбын қорғайды. Оның АТФ-аза активтілігі нашар, ал АТФ байланысуы молекула бетінде үшіншілік құрылымдардың қалыптасуына әкеледі. MutS кристалдық құрылымы оның өте асимметриялық екенін көрсетеді, және белсенді конформациясы димер болғанымен, екі жартысының тек біреуі ғана қате жұпталған орынмен өзара әрекеттеседі. Эукариоттарда MutS гомологтары екі негізгі гетеродимер құрайды: Msh2/Msh6 (MutSα) және Msh2/Msh3 (MutSβ). MutSα жолы негізінен базалық ауыстырулар мен кішкентай иілген сәйкессіздіктерді түзетуге қатысады. MutSβ жолы үлкен иілгендерді (~10 нуклеотидтік иілгендер) түзетуге қоса, кішкентай иілгендерді түзетуге де қатысады. Дегенмен, MutSβ базалық ауыстыруларды түзетпейді.

МТЛ гомологтары

MutL-де әлсіз АТФ-аза белсенділігі бар (қозғалыс үшін АТФ қолданылады). Ол MutS және MutH-пен кешен құрайды, бұл MutS-тың ДНК-дағы іздерін арттырады. Дегенмен, UvrD процессивтігі (фермент ДНК бойымен диссоциацияланбастан қозғала алатын қашықтық) шамамен 40–50 жұп база ғана. MutH жасаған тілік пен қате жұптың арақашықтығы орташа есеппен 600 жұп базаға жетеді. Егер тағы бір UvrD жүктелмесе, ажыратылған бөлік толықтырғыш тізбегімен қайта бірігіп, процесті бастапқы күйге қайтаруға мәжбүрлейді. Алайда, MutL көмегімен UvrD жүктелу жылдамдығы күрт артады. Жеке UvrD молекулаларының процессивтігі (және АТФ тұтынуы) өзгермейді, бірақ ДНК-ға жалпы әсері айтарлықтай күшейеді. ДНК қайтадан бірігуге мүмкіндік жоқ, себебі әр UvrD 40–50 жұп база ДНК-ны ажыратады, диссоциацияланады, содан кейін бірден басқа UvrD-мен алмастырылады, осылайша процесс қайталанады. Бұл ДНК-ның үлкен бөліктерін экзонуклеазамен ыдыратуға мүмкіндік береді, соның арқасында қате ДНК тез кесіліп (кейін алмастырылады). Эукариоттарда бес MutL гомологі бар: MLH1, MLH2, MLH3, PMS1 және PMS2. Олар E. coli бактериясындағы MutL-ге ұқсас гетеродимерлерді құрайды. Прокариоттық MutL-дің адам гомологтары үш кешенді құрайды: MutLα, MutLβ және MutLγ. MutLα кешені MLH1 және PMS2 суббірліктерінен, MutLβ гетеродимері MLH1 және PMS1-ден, ал MutLγ – MLH1 және MLH3-тен тұрады. MutLα эндонуклеаза ретінде әрекет етеді, қате жұптар мен басқа қажетті белоктар (MutSα және PCNA) белсендірілген кезде қыздық тізбекте үзілістер тудырады. Бұл тізбектегі үзілістер экзонуклеазаның әрекет етуіне кіру нүктесі болып табылады, ол қате ДНК-ны жояды. MutLβ және MutLγ-нің қателерді түзетудегі рөлі әлі толыққанды түсініксіз.

MutH: E. coli және Salmonella-да кездесетін эндонуклеаза

MutH – өте әлсіз эндонуклеаза, ол MutL-мен (өзі MutS-пен байланысқаннан кейін) байланысқанда ғана белсендіріледі. Ол метилденбеген ДНК-ны және жартылай метилденген ДНК-ның метилденбеген тізбегін кесіп тастайды, бірақ толық метилденген ДНК-ны кесіп тастамайды. Тәжірибелер көрсеткендей, егер екі тізбек те метилденбесе, қателерді түзету кездейсоқ болады. Осы қасиеттері MutH-тың қай тізбекте қате бар екенін анықтайтыны туралы ұсыныс жасауға әкелді. MutH-тың еукариоттарда гомологы жоқ. Оның эндонуклеазалық функциясын MutL гомологтары атқарады, олардың 5'-3' экзонуклеазалық белсенділігінің белгілі бір деңгейі бар. Эукариоттарда жаңа синтезделген қызыл тізбектен қателерді жоюға қатысты тізбек бағытталғандығы репликация кезінде пайда болатын жаңа тізбектегі Оказаки фрагменттерінің бос 3' ұштарымен қамтамасыз етілуі мүмкін.

PCNA β-сырғанақ тұтқа

PCNA және β сырғанау шүмегі тиісінше MutSα/β және MutS-пен байланысады. Алғашқы хабарламалар PCNA MutSα кешені сәйкессіздікті тануды күшейтуі мүмкін екенін көрсеткенімен, жақында MutSα-ның сәйкессіздікке деген туыстығы PCNA-ның болуымен немесе болмауымен ешқандай айқын өзгермейтіні анықталды. Бұдан әрі, in vitro жағдайында PCNA-мен өзара әрекеттесе алмайтын MutSα мутанттары сәйкессіздіктерді тану және сәйкессіздіктерді жою процесін жабайы типтік деңгейге жуық жүзеге асыра алады. Мұндай мутанттар 5' тізбектің үзілуімен бағытталатын жөндеу реакциясында кемшіліктерге ие, бұл реакцияның экзициядан кейінгі кезеңінде MutSα функциясының алғаш рет қатысуын көрсетеді.

Сәйкестікті жөндеудегі тұқым қуалаушылық ақаулар

Mut протеиндерінің адамдағы гомологтарындағы мутациялар геномдық тұрақтылыққа әсер етеді, бұл кейбір адам қатерлі ісіктеріне қатысы бар микросателлиттердің тұрақсыздығына (MSI) алып келуі мүмкін. Атап айтқанда, тұқым қуалайтын полипозсыз ішек-қолқа қатерлі ісігі (HNPCC немесе Линч синдромы) MutS және MutL гомологтарын кодтайтын MSH2 және MLH1 гендерінің зиянды нұсқаларына (варианттарына) байланысты болады, сондықтан олар қатерлі ісікті басушы гендер ретінде жіктеледі. HNPCC-ның бір түрі – Мьюр Торре синдромы (MTS) – тері ісіктерімен байланысты. Егер MMR генінің екі мұрагерлік көшірмесінде (аллельдерінде) зиянды генетикалық нұсқалар (варианттар) болса, онда өте сирек және ауыр жағдай туындайды: Дисмач жөндеу қатерлі ісік синдромы (немесе конституциялық дисмач жөндеу жеткіліксіздігі, CMMR D), ол жас жаста көптеген ісіктердің пайда болуымен, көбінесе ішек пен ми ісіктерімен көрінеді.

MSI және иммундық бақылау нүктесінің блокадалық жауабы

ММР және қателіктерді түзету мутациялары алғаш рет ПД1-ге қарсы препараттарға жақсы жауап берген пациенттерді зерттеуде иммундық бақылау нүктелерін блокадалаудың тиімділігімен байланысты екені байқалды. MSI-дың оң нәтижесі мен ПД1-ге қарсы препараттарға жақсы жауап беру арасындағы байланыс кейіннен перспективалық клиникалық сынауда расталды және FDA мақұлдады.

Адамдағы МРТ компоненттері

Адамда жеті ДНК сәйкессіздіктерін жөндеу (MMR) ақуыздары (MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1 және PMS2) ДНК сәйкессіздіктерін жөндеуді бастау үшін реттілік қадамдарда үйлесімді түрде жұмыс істейді. Сонымен қатар, Exo1-ге тәуелді және Exo1-ге тәуелсіз MMR қосалқы жолдары бар. Адамда сәйкессіздіктерді қалпына келтіруге қатысатын басқа ген өнімдері (MMR гендері бастағаннан кейін) ДНК полимераза дельта, PCNA, RPA, HMGB1, RFC және ДНК лигаза I, сондай-ақ гистон және хроматин модификациялайтын факторларды қамтиды. Белгілі бір жағдайларда MMR жолы қатеге бейім ДНК полимераза этаны (POLH) тартуы мүмкін. Бұл В лимфоциттерінде соматикалық гипермутация кезінде болады, онда POLH антидене гендеріне генетикалық өзгерістер енгізу үшін қолданылады. Дегенмен, бұл қатеге бейім MMR жолы генотоксиндерге ұшыраған кезде басқа да адам жасушаларында іске қосылуы мүмкін, және ол адамның түрлі қатерлі ісіктерінде кеңінен белсенді болып, POLH активтілігінің іздерін көрсететін мутацияларды тудырады.

MMR және мутация жиілігі

Жасушалар үшін сәйкессіздіктерді және индельдерді тану және жөндеу маңызды, өйткені осылай етпеу микросателлиттердің тұрақсыздығына (МСИ) және жоғарыланған спонтанды мутация деңгейіне (мутатор фенотипіне) әкеледі. Басқа қатерлі ісік түрлерімен салыстырғанда, ДНК жөндеу механизмі (ММР) жетіспейтін (МСИ) қатерлі ісіктерде мутациялардың жиілігі өте жоғары, меланома мен өкпе қатерлі ісігіне жақын, бұл қатерлі ісіктердің пайда болуына ультракүлгін сәулелену мен мутагенді химиялық заттардың көп мөлшерде әсер етуі себеп болады. Өте жоғары мутация жүктемесіне қоса, ММР жетіспеушілігі адам геномындағы соматикалық мутациялардың ерекше таралуына әкеледі: бұл ММР генге бай, ерте көбейтілетін эухроматикалық аймақтарды басымдықпен қорғайтынын көрсетеді. Ал гендерге кедей, кеш көбейтілетін гетерохроматикалық геномдық аймақтарда көптеген адам ісіктерінде мутациялардың жоғары деңгейі байқалады. Активті хроматиннің эпигенетикалық белгісі – H3K36me3 гистон модификациясы MSH2 MSH6 (hMutSα) кешенін тартуға қабілетті. Сәйкесінше, адам геномының жоғары H3K36me3 деңгейі бар аймақтары ММР активтілігіне байланысты аз мутация жинайды. Сонымен қатар, 135 асқазан қатерлі ісігінің сынамаларында MLH1 және MGMT экспрессиясы тығыз байланысты болды және MLH1 және MGMT жоғалуы ісіктің прогрессиясы кезінде синхронды түрде үдегендей көрінді. Бұл егеуқырлардың дамуы мен өмірі көбінесе қалыпты, ерте қатерлі ісік пен еркектердің сүйексіздігінен басқа.