Введение

Оптический микроскоп, также называемый световым микроскопом, – это тип микроскопа, который обычно использует видимый свет и систему линз для получения увеличенных изображений мелких объектов. Оптические микроскопы являются старейшей конструкцией микроскопа и, возможно, были изобретены в их современной составной форме в 17 веке. Основные оптические микроскопы могут быть очень простыми, хотя многие сложные конструкции направлены на улучшение разрешения и контрастности образца. Объект помещается на предметный столик и может просматриваться непосредственно через один или два окуляра микроскопа. В микроскопах с большим увеличением оба окуляра обычно отображают одно и то же изображение, но в стереомикроскопе используются слегка различающиеся изображения для создания трехмерного эффекта. Для захвата изображения обычно используется камера (микрофотография). Образец можно освещать различными способами. Прозрачные объекты можно освещать снизу, а непрозрачные – светом, проходящим через (светлое поле) или вокруг (темное поле) объектива. Поляризованный свет может использоваться для определения кристаллической ориентации металлических объектов. Фазово-контрастная микроскопия может использоваться для повышения контрастности изображения путем выделения мелких деталей с различным показателем преломления. Обычно имеется набор объективов с разным увеличением, установленных на револьверной головке, что позволяет вращать их и обеспечивать возможность масштабирования. Максимальная мощность увеличения оптических микроскопов обычно ограничена примерно 1000x из-за ограниченной разрешающей способности видимого света. Дальнейшее увеличение не позволяет различить дополнительные детали объекта. Альтернативы оптической микроскопии, не использующие видимый свет, включают сканирующую электронную микроскопию, просвечивающую электронную микроскопию и сканирующую зондовую микроскопию, что позволяет достичь гораздо большего увеличения.

Типы

Существует два основных типа оптических микроскопов: простые и сложные. Простой микроскоп использует оптическую силу одной линзы или группы линз для увеличения изображения. Сложный микроскоп использует систему линз (где один набор линз увеличивает изображение, созданное другим) для достижения значительно большего увеличения объекта. Подавляющее большинство современных исследовательских микроскопов – сложные, в то время как некоторые более дешевые коммерческие цифровые микроскопы являются простыми, с одной линзой. Сложные микроскопы, в свою очередь, можно разделить на различные типы, отличающиеся оптической схемой, стоимостью и областью применения.

Простой микроскоп

Простой микроскоп использует линзу или систему линз для увеличения объекта исключительно за счет углового увеличения, предоставляя наблюдателю прямое увеличенное виртуальное изображение. Одиночная выпуклая линза или группы линз применяются в простых увеличительных устройствах, таких как лупы, увеличительные стекла и окуляры для телескопов и микроскопов.

Цифровой микроскоп

Цифровой микроскоп – это микроскоп, оснащенный цифровой камерой, позволяющей наблюдать образец через компьютер. Микроскопы также могут управляться компьютером частично или полностью, с различной степенью автоматизации. Цифровая микроскопия обеспечивает более глубокий анализ изображения, например, измерение расстояний и площадей, а также количественную оценку флуоресцентного или гистологического окрашивания. В продаже также доступны цифровые микроскопы с небольшим увеличением, USB-микроскопы. По сути, это веб-камеры с мощным макрообъективом, которые, как правило, не используют просвечивание. Камера подключается непосредственно к USB-порту компьютера для отображения изображения на мониторе. Они обеспечивают умеренное увеличение (до примерно 200×) без необходимости использования окуляров и при очень низкой стоимости. Обычно для освещения используется светодиодный источник света или несколько источников, расположенных рядом с объективом камеры. Для предотвращения повреждения чувствительных биологических образцов доступна цифровая микроскопия с очень низкой интенсивностью света, использующая чувствительные цифровые камеры с подсчетом фотонов. Показано, что источник света, генерирующий пары запутанных фотонов, может минимизировать риск повреждения наиболее светочувствительных образцов. В этом применении метода "призрачной визуализации" к фотонно-разреженной микроскопии образец освещается инфракрасными фотонами, каждый из которых пространственно скоррелирован с запутанным партнером в видимом диапазоне для эффективной визуализации с помощью камеры подсчета фотонов.

Изобретение

Самыми ранними микроскопами были однолинзовые увеличительные стекла с ограниченным увеличением, известные как минимум со времен широкого распространения линз в очках в XIII веке. Составные микроскопы впервые появились в Европе около 1620 года, включая экземпляр, продемонстрированный Корнелисом Дреббелем в Лондоне (около 1621 года), и другой, выставленный в Риме в 1624 году. Истинный изобретатель составного микроскопа неизвестен, хотя на протяжении многих лет было сделано множество заявлений. Среди них – утверждение голландского мастера очков Йоханнеса Захариассена о том, что его отец, Захариас Янссен, изобрел составной микроскоп и/или телескоп еще в 1590 году. Показания Йоханнеса, которые некоторые считают сомнительными, отодвигают дату изобретения настолько далеко назад, что Захариас был бы ребенком в то время, что приводит к предположению, что для правдивости заявления Йоханнеса, составной микроскоп должен был изобрести дед Йоханнеса, Ханс Мартенс. Другое утверждение состоит в том, что конкурент Янссена, Ханс Липпершей (подавший заявку на патент на первый телескоп в 1608 году), также изобрел составной микроскоп. Другие историки указывают на голландского новатора Корнелиса Дреббеля с его составным микроскопом 1621 года, и/или возможность рассматривать объекты через противоположный конец в обратном порядке для увеличения мелких предметов. Единственным недостатком было то, что его двухфутовый телескоп необходимо было выдвигать до шести футов для рассматривания близких объектов. Увидев в 1624 году в Риме микроскоп, продемонстрированный Дреббелем, Галилей создал собственную улучшенную версию (Галилей назвал ее "occhiolino" или "маленький глаз"). Фабер образовал название от греческих слов μικρόν (микрон), означающего "маленький", и σκοπεῖν (скопейн), означающего "смотреть", название, призванное быть аналогичным "телескопу", другому слову, придуманному Линцеями. Кристиан Гюйгенс, еще один голландец, разработал простую двухлинзовую окулярную систему в конце XVII века, которая была ахроматически скорректирована и, следовательно, стала огромным шагом вперед в развитии микроскопа. Окуляр Гюйгенса до сих пор производится, но страдает от небольшого поля зрения и других незначительных недостатков.

Популяризация

Антонию ван Левенгуку (1632–1724) приписывают привлечение внимания биологов к микроскопу, хотя простые увеличительные линзы уже производились в XVI веке. Микроскопы, изготовленные ван Левенгуком самостоятельно, были простыми, с одной очень маленькой, но мощной линзой. Они были неудобны в использовании, но позволяли ван Левенгуку видеть детализированные изображения. Потребовалось около 150 лет развития оптики, прежде чем составной микроскоп смог обеспечить такое же качество изображения, как у простых микроскопов ван Левенгука, из-за сложностей в настройке нескольких линз. В 1850-х годах Джон Леонард Ридделл, профессор химии в Университете Тулейн, изобрел первый практичный бинокулярный микроскоп, проводя одно из первых и наиболее масштабных американских микроскопических исследований холеры.

Техника освещения

Основные технологии микроскопа и оптики доступны уже более 400 лет, однако методы освещения образцов, позволяющие получать высококачественные изображения, были разработаны значительно позже. В августе 1893 года Август Кёлер разработал метод Кёлер-освещения. Этот метод освещения образцов обеспечивает исключительно равномерную освещенность и устраняет многие недостатки более ранних техник освещения. До разработки Кёлер-освещения изображение источника света, например нити накаливания лампы, всегда было видно на изображении образца. В 1953 году голландский физик Фриц Зернике был удостоен Нобелевской премии по физике за разработку фазово-контрастного освещения, которое позволяет визуализировать прозрачные образцы. Используя интерференцию вместо поглощения света, можно получать изображения чрезвычайно прозрачных образцов, таких как живые клетки млекопитающих, без необходимости применения методов окрашивания. Всего через два года, в 1955 году, Жорж Номарски опубликовал теорию дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии – еще одной методики визуализации, основанной на интерференции.

Флуоресцентная микроскопия

Современная биологическая микроскопия во многом зависит от разработки флуоресцентных зондов для специфических структур внутри клетки. В отличие от обычной микроскопии с просвечиванием, в флуоресцентной микроскопии образец освещается через объектив узким диапазоном длин волн света. Этот свет взаимодействует с флюорофорами в образце, которые затем испускают свет с большей длиной волны. Именно это испущенное свечение формирует изображение. С середины XX века для маркировки определенных структур внутри клетки используются химические флуоресцентные красители, такие как DAPI, связывающийся с ДНК. Более поздние разработки включают иммунофлуоресценцию, использующую флуоресцентно меченые антитела для распознавания специфических белков в образце, и флуоресцентные белки, такие как GFP, которые живая клетка может экспрессировать, делая ее флуоресцентной.

Очковая линза

Окуляр, или глазная линза, представляет собой цилиндр, содержащий две или более линз; его функция заключается в фокусировке изображения для глаза. Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Окуляры взаимозаменяемы, и можно использовать различные окуляры с разной степенью увеличения. Типичные значения увеличения для окуляров включают 5×, 10× (наиболее распространенное), 15× и 20×. В некоторых высококачественных микроскопах оптическая схема объектива и окуляра подбирается для достижения наилучшей оптической производительности. Это наиболее часто встречается с апохроматическими объективами.

Башня объектива (револьвер или вращающаяся носовая часть)

Объективная башня, револьвер или вращающаяся головка – это часть микроскопа, в которой закреплены объективы. Она позволяет пользователю переключаться между разными объективами.

Объективная линза

На нижнем конце типичного составного оптического микроскопа располагается одна или несколько объективных линз, собирающих свет от образца. Объектив обычно помещен в цилиндрический корпус, содержащий стеклянную одно- или многоэлементную составную линзу. Как правило, к вращающемуся круговому револьверу привинчиваются около трех объективных линз, позволяющих выбрать необходимую. Эти конструкции разработаны таким образом, чтобы быть парфокальными, то есть при переключении между линзами на микроскопе образец остается в фокусе. Объективы микроскопа характеризуются двумя параметрами: увеличением и числовой апертурой. Увеличение обычно варьируется от 5× до 100×, а числовая апертура – от 0,14 до 0,7, что соответствует приблизительно 40–2 мм фокусного расстояния соответственно. Объективные линзы с большим увеличением, как правило, имеют более высокую числовую апертуру и меньшую глубину резкости на полученном изображении. Для достижения оптимальной оптической производительности некоторые высококачественные объективы могут требовать подобранных окуляров.

Цель погружения в масло

Некоторые микроскопы используют объективы с иммерсионным маслом или иммерсионной водой для достижения большего разрешения при большом увеличении. Они применяются с материалом, согласованным по показателю преломления, таким как иммерсионное масло или вода, и соответствующим покровным стеклом между объективом и образцом. Показатель преломления согласовывающего материала выше, чем у воздуха, что позволяет объективу иметь большую числовую апертуру (больше 1), благодаря чему свет передается от образца к внешней поверхности объектива с минимальным преломлением. Можно достичь числовых апертур до 1,6. Большая числовая апертура обеспечивает сбор большего количества света, что делает возможным детальное наблюдение мелких деталей. Объектив с иммерсионным маслом обычно имеет увеличение от 40 до 100×.

Ручки фокусировки

Ручки регулировки перемещают предметный столик вверх и вниз, обеспечивая раздельную настройку для грубой и точной фокусировки. Те же органы управления позволяют микроскопу адаптироваться к образцам различной толщины. В более ранних конструкциях микроскопов колеса регулировки фокусировки перемещали микроскопную трубку вверх или вниз относительно подставки, а предметный столик был неподвижным.

Рама

Весь оптический блок традиционно крепится к жесткому рычагу, который, в свою очередь, крепится к прочной U-образной опоре для обеспечения необходимой жесткости. Угол рычага может быть регулируемым, чтобы можно было изменять угол обзора. Рама обеспечивает точку крепления для различных органов управления микроскопом. Обычно это включает в себя органы управления фокусировкой, как правило, большое рифленое колесо для грубой настройки фокуса и меньшее рифленое колесо для точной настройки фокуса. Также могут присутствовать органы управления лампой и/или регулировкой конденсора.

Этап

Сцена – это платформа, расположенная под объективом, которая служит опорой для рассматриваемого препарата. В центре сцены имеется отверстие для прохождения света, освещающего препарат. Обычно на сцене есть зажимы для фиксации предметных стекол (прямоугольных стеклянных пластин стандартного размера 25×75 мм, на которые монтируется препарат). При увеличениях, превышающих 100×, перемещение предметного стекла вручную становится затруднительным. Механическая сцена, характерная для микроскопов средней и высокой ценовой категории, позволяет осуществлять точное перемещение стекла с помощью управляющих ручек, что позволяет позиционировать образец/стекло по желанию. Если микроскоп изначально не был оснащен механической сценой, возможно ее дополнительное приобретение и установка. Все сцены перемещаются вверх и вниз для фокусировки. Механическая сцена обеспечивает перемещение стекла по двум горизонтальным осям для точного позиционирования препарата при изучении его деталей. Фокусировка начинается с малого увеличения для центрирования препарата пользователем на сцене. Переход к большему увеличению требует поднятия сцены для повторной фокусировки и может потребовать незначительной корректировки горизонтального положения препарата. Горизонтальная регулировка положения препарата – основное назначение механической сцены. Ввиду сложности подготовки препаратов и их размещения на предметных стеклах, детям рекомендуется начинать работу с готовыми препаратами, которые уже центрированы и легко фокусируются независимо от используемого увеличения.

Источник света

Можно использовать множество источников света. В простейшем случае дневной свет направляется с помощью зеркала. Однако большинство микроскопов оснащены собственным регулируемым и контролируемым источником света – часто галогенной лампой, хотя всё чаще используется освещение светодиодами и лазерами. Кёлер-освещение обычно предусмотрено в более дорогих приборах.

Конденсатор

Конденсатор – это линза, предназначенная для фокусировки света от источника освещения на образец. Конденсатор может также включать в себя другие элементы, такие как диафрагма и/или фильтры, для управления качеством и интенсивностью освещения. Для методов освещения, таких как темнопольная, фазово-контрастная и дифференциально-интерференционная микроскопия, дополнительные оптические компоненты должны быть точно выровнены в световом пути.

Увеличение

Фактическая мощность или увеличение сложного оптического микроскопа является произведением увеличения окуляра и объектива. Например, окуляр с увеличением 10x и объектив с увеличением 100x дают общее увеличение в 1000x. Измененные условия, такие как использование иммерсионного масла или ультрафиолетового света, могут повысить разрешение и позволить рассмотреть детали при увеличениях, превышающих 1000x.

Методы освещения

Существует множество методов, изменяющих путь света для получения изображения с улучшенным контрастом от образца. Основные методы повышения контраста образца включают в себя поляризованный свет с перекрестной поляризацией, темное поле, фазовый контраст и дифференциально-интерференционный контраст. Недавно разработанный метод (Sarfus) сочетает поляризованный свет с перекрестной поляризацией и специальные предметные стекла с усиленным контрастом для визуализации нанометровых образцов.

Приложения

Оптическая микроскопия широко используется в микроэлектронике, нанофизике, биотехнологии, фармацевтических исследованиях, минералогии и микробиологии. Она применяется для медицинской диагностики, при этом исследование тканей называется гистопатологией, а анализ мазков свободных клеток или фрагментов тканей – цитологией. В промышленности часто используются бинокулярные микроскопы. Помимо областей, требующих восприятия глубины, использование двух окуляров снижает утомляемость глаз при длительной работе за микроскопом. В некоторых случаях полезны микроскопы с большим рабочим расстоянием или длиннофокусные микроскопы. Это может потребоваться, например, для исследования объекта за стеклом или если промышленные образцы представляют опасность для объектива. Подобная оптика напоминает телескопы, способные фокусироваться на близких расстояниях. Для прецизионных измерений используются измерительные микроскопы. Существует два основных типа: один оснащен сетчатой шкалой для измерения расстояний в фокальной плоскости, а другой (более старый) – простыми перекрестными нитями и микрометрическим механизмом для перемещения объекта относительно микроскопа. Компактные портативные микроскопы находят применение там, где использование лабораторного микроскопа затруднительно.

Ограничения

При очень высоких увеличениях при прохождении света точечные объекты видны как размытые диски, окруженные дифракционными кольцами. Они называются дисками Эйри. Разрешающая способность микроскопа определяется как способность различать два близко расположенных диска Эйри (или, иными словами, способность микроскопа отображать смежные структурные детали как отдельные и четкие). Именно дифракция ограничивает возможность различения мелких деталей. На характер и интенсивность дифракционных картин влияют длина волны света (λ), показатели преломления материалов, используемых для изготовления объектива, и числовая апертура (NA) объектива. Таким образом, существует конечный предел, за которым невозможно различить отдельные точки в поле зрения объектива, известный как дифракционный предел. При условии, что оптические аберрации в оптической системе незначительны, разрешение d можно выразить следующим образом:

Обычно используется длина волны 550 нм, соответствующая зеленому свету. При использовании воздуха в качестве внешней среды максимальная практическая NA составляет 0,95, а при использовании иммерсионного масла – до 1,5. На практике минимальное значение d, достижимое с помощью обычных объективов, составляет около 200 нм. Новый тип объектива, использующий многократное рассеяние света, позволил улучшить разрешение до менее чем 100 нм.

Превышение предела разрешения

Доступно несколько методов для достижения разрешения выше дифракционного предела, описанного выше. Голографические методы, описанные Куржоном и Булабуа в 1979 году, также способны преодолеть этот предел разрешения, хотя в их экспериментальном анализе разрешение было ограничено. При использовании флуоресцентных образцов становится доступно больше методов. К ним относятся Vertico SMI, сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля, использующая эванесцентные волны, и стимулированное излучение с истощением. В 2005 году был описан микроскоп, способный обнаруживать отдельные молекулы, как учебное пособие. Несмотря на значительный прогресс за последнее десятилетие, методы преодоления дифракционного предела остаются ограниченными и специализированными. В то время как большинство методов направлены на увеличение бокового разрешения, существуют также методы, позволяющие анализировать чрезвычайно тонкие образцы. Например, методы сарфуса помещают тонкий образец на поверхность, усиливающую контраст, что позволяет напрямую визуализировать пленки толщиной всего 0,3 нанометра. 8 октября 2014 года Эрику Бетцигу, Уильяму Моернеру и Стефану Хеллу была присуждена Нобелевская премия по химии за разработку флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения.

Структурированное освещение SMI

SMI (пространственно модулированная микроскопия освещения) – это оптический метод, основанный на формировании функции рассеяния точки (PSF). Это процессы, которые модифицируют PSF микроскопа для увеличения оптического разрешения, повышения точности измерения расстояний до флуоресцентных объектов, размеры которых малы по сравнению с длиной волны освещающего света, или для получения других структурных параметров в нанометровом диапазоне.

Локализационная микроскопия SPDMphymod

SPDM (спектральная точность дистанционной микроскопии), базовая технология локализационной микроскопии, – это светооптический процесс флуоресцентной микроскопии, позволяющий проводить измерения положения, расстояния и угла для "оптически изолированных" частиц (например, молекул) с разрешением, значительно превышающим теоретический предел разрешения световой микроскопии. "Оптически изолированный" означает, что в данный момент времени регистрируется только одна частица/молекула в области, размер которой определяется обычным оптическим разрешением (обычно около 200–250 нм в диаметре). Это становится возможным, когда молекулы в такой области несут различные спектральные маркеры (например, разные цвета или другие различимые характеристики свечения разных частиц). Для локализационной микроскопии можно использовать многие стандартные флуоресцентные красители, такие как GFP, красители Alexa, Atto, Cy2/Cy3 и молекулы флуоресцеина, при соблюдении определенных фотофизических условий. При использовании технологии SPDMphymod (физически модифицируемые флюорофоры) для наноизображения достаточно одной лазерной длины волны подходящей интенсивности.

3D микроскопия сверхвысокой разрешения

3D-микроскопия сверхвысокого разрешения со стандартными флуоресцентными красителями может быть достигнута путем комбинирования локализационной микроскопии SPDMphymod для стандартных флуоресцентных красителей и микроскопии с структурированным освещением SMI.

СТЭД

Стимулированное истощение эмиссии – простой пример того, как возможно достижение разрешения, превышающего дифракционный предел, однако этот метод имеет существенные ограничения. STED – это метод флуоресцентной микроскопии, использующий комбинацию световых импульсов для возбуждения флуоресценции в небольшой субпопуляции флуоресцентных молекул в образце. Каждая молекула создает в изображении дифракционно-ограниченное пятно света, центр которого соответствует её местоположению. Поскольку количество флуоресцирующих молекул невелико, эти пятна света вряд ли перекрываются, что позволяет точно определять их положение. Этот процесс многократно повторяется для создания изображения. Стефан Хелл из Института биофизической химии имени Макса Планка был удостоен 10-й немецкой премии «Будущее» в 2006 году и Нобелевской премии по химии в 2014 году за разработку микроскопа STED и сопутствующих методик.