Кіріспе

Флуоресценттік корреляциялық спектроскопия (ФКС) – флуоресценция интенсивтілігінің стационарлық флуктуацияларын уақыт корреляциясы арқылы статистикалық талдау. Оның теориялық негізі Л. Онсагердің регрессиялық гипотезасынан туындады. Талдау, флуктуациялардың негізінде жатқан физикалық процестердің кинетикалық параметрлерін береді. Осының бір қызықты қолданысы – ерітіндідегі флуоресцентті бөлшектердің (молекулалардың) концентрация флуктуацияларын талдау. Бұл қолданыста, флуоресцентті бөлшектердің (молекулалардың) азау саны бар ерітіндідегі өте кішкентай кеңістіктен шығатын флуоресценция байқалады. Флуоресценция интенсивтілігі бөлшектердің Браундық қозғалысының салдарынан флуктуацияланады. Басқаша айтқанда, оптикалық жүйемен анықталған субкеңістіктегі бөлшектердің саны орташа санның төңірегінде кездейсоқ түрде өзгереді. Талдау флуоресцентті бөлшектердің орташа санын және бөлшектің кеңістік арқылы өтуінің орташа диффузиялық уақытын анықтайды. Соңында, бөлшектің (молекуланың) концентрациясы мен мөлшері анықталады. Екі параметр де биохимиялық зерттеулерде, биофизикада және химияда маңызды. ФКС – өте сезімтал талдау құралы, себебі ол шағын көлемде (~1 мкм³) молекулалардың азау санын (наномолярлықтан пикомолярлық концентрацияға дейін) байқайды. Басқа әдістерден (мысалы, HPLC талдауынан) айырмашылығы, ФКС физикалық бөліну процесіне ие емес; керісінше, ол кеңістіктік ажыратымдылығын оптикасы арқылы қамтамасыз етеді. Сонымен қатар, ФКС тірі жасушалардың биохимиялық жолында флуоресценциямен таңбаланған молекулаларды байқауға мүмкіндік береді. Бұл «in situ немесе in vivo биохимиясы» деп аталатын жаңа саланың есігін ашады: тұтас жасушалар мен органдарда биохимиялық жолды іздеу. ФКС көбінесе оптикалық микроскопия контекстінде, әсіресе конфокалды микроскопияда немесе екі фотондық қоздыру микроскопиясында қолданылады. Бұл әдістерде жарық үлгіге шоғырландырылады және өлшенген флуоресценция интенсивтілігінің флуктуациялары (диффузия, физикалық немесе химиялық реакциялар, агрегация және т.б. салдарынан) уақыт автокорреляциясын пайдалана отырып талданады. Өлшенетін қасиет негізінен флуктуациялардың шамасымен және/немесе мөлшерімен байланысты болғандықтан, бақылау көлеміне жеке түрлердің кіруі немесе шығуы деңгейінде (немесе көлемде қосылуы және сөнуі) оптималдық өлшеу режимі бар. Бір уақытта тым көп объектілер өлшенгенде, жалпы флуктуациялар жалпы сигналмен салыстырғанда аз болады және шешілмейді – керісінше, егер жеке флуктуациялық оқиғалар уақыт бойынша тым сирек болса, бір өлшеу тым ұзаққа созылуы мүмкін. ФКС – динамикалық жарық шашырауының флуоресценттік аналогы, ол (когерентті емес) флуоресценцияның орнына когерентті жарық шашырауын пайдаланады. Тиісті модель белгілі болғанда, ФКС диффузиялық коэффициенттер, гидродинамикалық радиустар, орташа концентрациялар, кинетикалық химиялық реакциялар жылдамдықтары, синглет-триплет динамикасы сияқты сандық ақпарат алу үшін қолданылуы мүмкін. Флуоресценттік маркерлердің әртүрлі түстерде болуы және нақты молекулаға (мысалы, ақуыздар, полимерлер, металл кешендері және т.б.) арнайы байланыстырылуы мүмкін болғандықтан, жеке молекулалардың мінез-құлқын зерттеуге болады (қосылған ерітінділерде жылдам түрде). Лавиналық фотодиодтар сияқты сезімтал детекторлардың дамуымен жоғары сұйытылған үлгілердегі жеке молекулалардан келетін флуоресценция сигналын анықтау практикалық болды. Осының нәтижесінде, материалтанудан биологияға дейінгі көптеген үлгілерде ФКС эксперименттерін жүргізу мүмкіндігі пайда болды. Генетикалық таңбаланған ақуыздармен (жасыл флуоресцентті ақуыз сияқты) жасалған жасушалардың пайда болуы ФКС-ті тірі жасушалардағы молекулалық динамиканы зерттеудің кең таралған құралына айналдырды.

Тарих

Сигналды байланыстыру әдістерін алғаш рет 1972 жылы Магде, Элсон және Уэбб флуоресценцияға қатысты эксперименттік түрде қолданды, сондықтан олар FCS-тің "авторлары" ретінде танылады. Осы және басқа авторлар техниканы көп ұзамай жариялаған бірнеше мақала арқылы одан әрі дамытып, теориялық негіздерін және қолдану салаларын қалыптастырды. 1990 жылдар шамасында флуоресценция бөлшектерінің жеткілікті түрде аз санын анықтау мүмкіндігі туған кезде екі мәселе пайда болды: флуоресценция интенсивтілігінің Гаусс таралуынан ауытқуы және лазерлік микроскопия жүйесінің үш өлшемді конфокалды өлшеу көлемі. Алғашқысы молекулалық ақпаратты алу үшін флуоресценттік сигналдардың таралуы мен моменттерін талдауға әкелді, нәтижесінде "Жарқылық талдау" деп аталатын әдістер жиынтығы пайда болды. Осы кезеңге шолу үшін Thompson (1991) еңбегіне жүгініңіз. 1993 жылдан бастап, өлшеу техникасындағы бірқатар жетістіктер – әсіресе конфокалды микроскопияны, содан кейін екі фотондық микроскопияны қолдану – өлшеу көлемін жақсырақ анықтауға және фондық сигналды жоюға мүмкіндік берді, бұл сигнал мен шу арақатынасын едәуір жақсартты және жеке молекулалық сезімталдыққа қол жеткізуге ықпал етті. Содан бері FCS-ке қызығушылық жаңадан оянды, және 2007 жылдың тамызына қарай Web of Science дерекқорында FCS қолданылған 3000-нан астам мақала табылды. Шолу үшін Кричевский мен Боннетті қараңыз. Бұған қоса, FCS-ті әртүрлі бағыттарда кеңейтуге қатысты белсенді жұмыстар жүргізілуде, мысалы, лазерлік сканерлеу және айналмалы дискілі конфокалды микроскопияға (стационарлық, бір нүктелік өлшеуден), автокорреляцияның орнына екі флуоресценттік канал арасындағы кросс-корреляцияны (FCCS) қолдануға, сондай-ақ флуоресценцияның орнына Förster резонанстық энергия беруді (FRET) пайдалануға қатысты.

Үлгілік құрылғы

Типтік FCS орнатылымы лазерлік сызықтан (әдетте 405–633 нм (тұрақты толқынды) және 690–1100 нм (импульстік) толқын ұзындығы) тұрады, ол дихроикалық айна арқылы микроскоп объективіне шағылыстырылады. Лазерлік сәуле флуоресцентті бөлшектер (молекулалар) бар үлгіге шоғырландырылады, олар соншалықты жоғары сұйытылған, олардың тек бірнешеуі ғана фокус нүктесінде болады (әдетте бір фл-де 1–100 молекула). Бөлшектер фокустық көлемнен өткенде, олар флуоресценция шығарады. Бұл жарық сол объективпен жиналады және қоздыру жарығына қарағанда қызылға қарай ығысқандықтан, дихроикалық айнадан өтіп, әдетте фотокөбейтуші түтік, лавиналық фотодиод детекторы немесе суперөткізгіш наносымдардан жасалған бір фотондық детекторға жетеді. Нәтижесіндегі электрондық сигнал кейінірек талдау үшін интенсивтілік пен уақыттың графигі түрінде тікелей сақталуы мүмкін, немесе автоматты түрде корреляцияны есептеу үшін қолданылуы мүмкін (бұл үшін арнайы деректерді жинау карталары қажет). FCS қисығы өзі уақыт спектрін ғана көрсетеді. Физикалық құбылыстар туралы қорытындылар тиісті модельдерді қолдану арқылы одан шығарылуы керек. Қызығушылық тудыратын параметрлер автокорреляция қисығын модельделген функциялық түрлерге сәйкестендіргеннен кейін анықталады.

Өлшем көлемі

Өлшем көлемі – жарықтандыру (экцитация) және детекция геометриясының конволюциясы, ол қолданылатын оптикалық элементтердің нәтижесінде пайда болады. Алынған көлем математикалық тұрғыдан нүктелік таралу функциясы (немесе PSF) арқылы сипатталады, ол, негізінен, нүктелік көздің бейнесі болып табылады. PSF көбінесе бірнеше жүз нанометрлік фокус диаметрі бар эллипсоид ретінде сипатталады (шекаралары анық емес), ал оптикалық ось бойымен шамамен бір микрометрге дейін созылады. Формасы оптикалық элементтердің сапасына байланысты айтарлықтай өзгереді (бұл FCS қисықтарының нәтижесіне үлкен әсер етеді), сондықтан астигматизмнен сақтану және құралда PSF-тің нақты пішінін тексеру өте маңызды. Конфокалды микроскопияда және кішкентай диафрагмалар үшін (бір Эйри бірлігі шамасында) PSF гаусс функциясымен жақсы жуықталады:

мұнда – ең жоғары қарқындылық, r және z – радиалдық және осьтік координаталар, ал – радиалдық және – осьтік радиустар. Автокорреляцияның функционалдық түрін алу үшін осы гаусс функциясы қолданылады. Әдетте = 200–300 нм, ал = 2–6 есе үлкен. Өлшем көлемінің параметрлерін калибрлеудің бір әдеттегі тәсілі – белгілі диффузиялық коэффициенті және концентрациясы бар заттарға FCS жүргізу (қараңыз төменде). Судағы кең таралған флюорофорлардың диффузия коэффициенттері кейінірек берілген. Гаусс жуықтамасы оптикалық ерекшеліктерге байланысты әртүрлі дәрежеде жарамды, ал жуықтамадағы қателерді жою үшін түзетулер қолданылуы мүмкін.

Автокорреляция функциясын түсіндіру

Қызығушылық тудыратын шамаларды алу үшін автокорреляциялық деректерді, әдетте, сызықтық емес ең кіші квадраттар алгоритмін пайдаланып, сәйкестендіруге болады. Сәйкестендірудің функционалдық пішіні динамика түріне (және сұрақ тудыратын оптикалық геометрияға) байланысты.

Үштік күйін түзету

Жоғарыда көрсетілген автокорреляциялар ауытқулар бөлшектердің флуоресценттік қасиеттерінің өзгеруіне байланысты емес деп есептейді. Дегенмен, көптеген (био)органикалық флюорофорлар үшін – мысалы, жасыл флуоресцентті ақуыз, родамин, Cy3 және Alexa Fluor бояулары – жарыққа түскен бөлшектердің бір бөлігі үштік күйге (немесе басқа да радиациялық емес ыдырау күйлеріне) өтеді де, одан кейін белгілі бір демалыс уақыты бойы фотондарды шығара алмайды. Бұл уақыт әдетте микросекундтармен өлшеніп, көбінесе қызығушылық тудыратын динамикадан кіші (мысалы), бірақ өлшеуге мүмкіндік беретіндей жеткілікті. Автокорреляцияға үштік күйді ескеретін көбейту мүшесі қосылады. Қалыпты диффузия үшін:

мұнда – үштік күйге өткен бөлшектердің үлесі, ал – сәйкес үштік күйдің демалыс уақыты. Егер қызығушылық тудыратын динамика үштік күйдің демалысынан әлдеқайда баяу болса, автокорреляцияның қысқа уақыт компонентін қысқартуға болады және үштік мүше қажет емес.

Флуоресценттік қиылысты корреляциялық спектроскопия (FCCS)

Кейде FCS молекулалық өзара әрекеттесулерді диффузия уақытының айырмашылығын пайдалана отырып зерттеу үшін қолданылады (мысалы, ассоциациялық реакцияның өнімі ірі болады, сондықтан оның диффузия уақыты жеке реактанттардың диффузия уақытынан үлкен болады); алайда, FCS молекулалық массаға салыстырмалы түрде сезімтал емес, шар тәрізді бөлшектердің (мысалы, ақуыздардың) диффузия уақытын молекулалық массамен байланыстыратын келесі теңдеуден көрінеді:

мұнда – сынаманың тұтқырлығы, ал – флуоресцентті түрдің молекулалық массасы. Іс жүзінде диффузия уақыттары жеткілікті түрде ерекшеленуі керек – кем дегенде 1,6 есе, яғни молекулалық массалар 4 еседен кем болмауы керек. Екі түсті флуоресценттік қиылыс корреляциялық спектроскопия (FCCS) екі немесе одан көп флуоресценттік арналарды (әр реактант үшін бір арна) қиылысты корреляциялау арқылы өзара әрекеттесулерді өлшейді, бұл FCS-ке қарағанда өзара әрекеттесулерді әлдеқайда сезімтал түрде ажыратады, әсіресе реакциядағы масса өзгерісі шағын болғанда.

Жарықтықты талдау әдістері

Бұл әдістер жиынтығына сан мен жарықтылық (N&B), фотондарды санау гистограммасы (PCH), флуоресценция интенсивтілік үлестірілімін талдау (FIDA) және кумулятивті талдау кіреді, сондай-ақ кеңістіктік интенсивтілік үлестірілімін талдау. Бірнеше әдістің үйлесімде қолданылуы туралы да хабарламалар бар. Флуоресценттік қиылысты корреляциялық спектроскопия көп түсті сәйкестіктерді қарастыра отырып, диффузия жылдамдығының молекулалық массаға нашар тәуелділігін жоғарылатады. Ал гомо-әрекеттесулерге қатысты не деуге болады? Шешім жарықтық талдауында. Бұл әдістер флуоресценция интенсивтілігінің таралуындағы әртүрліліктерді пайдаланып, үлгідегі әртүрлі түрлердің молекулалық жарықтығын өлшейді. Димерлерде мономерлерге қарағанда екі есе көп флуоресценттік маркерлер болады, сондықтан олардың молекулалық жарықтығы мономерлерге қарағанда шамамен екі есе артық болады. Осының салдарынан, салыстырмалы жарықтық олигомеризация деңгейін анықтауға сезімтал. Орташа молекулалық жарықтық дисперсиямен (варианс) және орташа интенсивтілікпен келесідей байланысты:

Мұнда және түрлердің фракциялық интенсивтілігі мен молекулалық жарықтығын көрсетеді.

FRET-FCS

Молекулалық өзара әрекеттесулерді зерттеуге арналған тағы бір FCS негізделген тәсіл флуоресценцияның орнына флуоресценциялық резонанстық энергия беруді (FRET) пайдаланады және FRET FCS деп аталады. FRET-те FCCS сияқты екі түрлі зонд қолданылады; бірақ тек бір арна бар және екі зонд өте жақын болғанда ғана, яғни өзара әрекеттесуді қамтамасыз ететіндей жақын болғанда жарық анықталады. FRET сигналы флуоресценцияға қарағанда әлсіз, бірақ оның артықшылығы реакция кезінде ғана сигнал беруі (автофлуоресценциядан басқа).

FCS сканерлеу

Сканерлік флуоресценттік корреляциялық спектроскопияда (sFCS) өлшеу көлемі үлгі бойынша белгілі бір жолмен жылжытылады. Сканерлеуді енгізудің себебі – оның стандартты FCS-де жиі кездесетін бірнеше мәселені жеңілдету немесе жою мүмкіндігі, соның арқасында биологиялық жүйелерде флуоресценциялық корреляциялық әдістердің қолданылу аймағы кеңейеді. FCS-тің кейбір түрлері тек сериялық сканерлеуші лазерлік микроскоптарда ғана қолданылады. Кескін корреляциялық спектроскопия және оның түрлері сканерлік конфокалды немесе сканерлік екі фотондық микроскоптарда іске асырылды, бірақ оларды айналмалы диск конфокалды микроскоп сияқты басқа микроскоптарға да бейімдеуге болады. Растрлық ICS (RICS) және позицияға сезімтал FCS (PSFCS) кескін сканерлеу бөліктері арасындағы уақыт кешігуін талдауға қосады. Сондай-ақ, төмен өлшемді сканерлеулер (мысалы, дөңгелек сақина) – тек сканерлеуші жүйеде ғана мүмкін болатын – жеке нүктелік және толық кескін өлшемдері арасындағы уақыт шкаласын анықтауға мүмкіндік береді. Сканерлеу жолы бөлшектерді адаптивті түрде қадағалау үшін де жасалған.

Айналмалы дискі FCS және кеңістікті карталау

Кез келген суреттік корреляциялық спектроскопия әдістерін айналмалы дискілі конфокалды микроскопта да орындауға болады, ол практикада лазерлік сканерлеу конфокалды микроскоппен салыстырғанда жылдам суретке түсіру жылдамдығын қамтамасыз етеді. Бұл тәсіл жақында кеңістікте әртүрлі күрделі ортадағы диффузияға қолданылып, диффузия коэффициентінің пиксельдік картасын жасады. FCS көмегімен диффузияның кеңістіктік картасы кейін TIRF жүйесіне ұзартылды. Динамиканың кеңістіктік картасын жасау үшін бұрыңғыда да корреляциялық техникалар қолданылған, бірақ тек сирек нүктелерде немесе нашар ажыратымдылықта. Содан кейін өлшемдер орташаланады. ICS-тің тағы бір түрі кескіндерде кеңістіктік автокорреляцияны жүргізеді, бұл бөлшектердің концентрациясы туралы ақпарат береді. Содан кейін корреляция уақыт бойынша орташаланады. Камераның ақ шуы уақыт бойынша автокорреляцияланбаса да, кеңістікте автокорреляцияланады – бұл кеңістіктік автокорреляциялық функцияда ақ шу амплитудасын тудырады, оны флуоресценттік молекулалардың концентрациясын анықтау үшін корреляциялық амплитуданы сәйкестендіру кезінде ескеру қажет. Уақыттық және кеңістіктік корреляциялық нұсқаулардың табиғи жалғасы – кеңістіктік-уақыттық ICS (STICS). STICS-те кеңістікте немесе уақытта нақты орташалау болмайды (тек корреляцияға тән орташалау). Изотропты емес қозғалысы бар жүйелерде (мысалы, бағытталған ағын, асимметриялық диффузия) STICS бағыттық ақпаратты алуға мүмкіндік береді. STICS-ке (Фурье түрлендіруі арқылы) тығыз байланысты нұсқа – k кеңістігіндегі суреттік корреляциялық спектроскопия (kICS). ICS-тің қиылыс корреляциялық нұсқалары да бар, олар бірге орналасқан флуоресценттік молекулалардың концентрациясын, таралуын және динамикасын анықтай алады. PICS – нанометрлік ұзындық және миллисекундтық уақыт шкаласындағы корреляцияларды анықтайтын қуатты талдау құралы. Уақыттық-кеңістіктік суреттік корреляциялық спектроскопия әдістерінен алынған.

FCS жоғары ажыратылуы бар оптикалық флуктуациялық бейнелеу (fcsSOFI)

Суперрезолюциялық оптикалық флуктуациялық бейнелеу (SOFI) – FCS-ке ұқсас корреляциялық теңдеулермен пост-өңдеу талдауы арқылы дифракция шегінен төменгі кеңістіктік ажыратымдылыққа қол жеткізуге мүмкіндік беретін суперрезолюциялық әдіс. SOFI туралы алғашқы хабарламаларда флюорофорлардың тұрақсыздығы мен жыпылықтауы пайдаланылса, FCS SOFI-мен біріктірілді, онда диффузиялық зондтардың қозғалысынан диффузия коэффициенттерінің суперрезолюциялық кеңістіктік карталарын құру үшін флуктуациялар туындатылады. Бұл кеуекті және шектеулі материалдардың диффузиялық және кеңістіктік қасиеттерін түсіну үшін қолданылды. Мысалы, агароза сұйық кристалдары.

Жалпы ішкі шағылысу FCS

Толық ішкі шағылысу флуоресценциясы (TIRF) – бұл тек қаптаманың бетіне жақын жұқа қабатқа ғана сезімтал болатын микроскопиялық әдіс, бұл фондық флуоресценцияны едәуір азайтады. FCS осы типтегі микроскопқа бейімделді және TIR FCS деп аталады. TIRF-та флуоресценция интенсивтігі қаптамадан қашықтықпен экспоненциалды түрде төмендейді (конфокалды микроскопиядағы Гаусс қисығы сияқты емес), сондықтан автокорреляция функциясы өзгеше болады.

Жарық табақты флуоресценттік микроскопияны қолдану арқылы FCS бейнелеу

Жарық табақты флуоресценциялық микроскопия немесе селективті жазықтық бейнелеу микроскопиясы (SPIM) бақылау бағытына перпендикуляр түсірілетін, (лазерлік) жарықтың жұқа табағын пайдалану арқылы жарықтандыруды қолданады. Белгілі бір жағдайларда, бұл жарықтандыру принципі флуоресценттік корреляциялық спектроскопиямен біріктіріліп, тірі биологиялық үлгілерде GFP белгіленген ақуыздар сияқты флуоресцентті бөлшектердің қозғалысын және өзара әрекеттесуін кеңістікте ажырату арқылы бейнелеуге мүмкіндік береді.

Басқа флуоресценттік динамикалық тәсілдер

Флуоресценттік түрлер динамикасын зерттеу үшін жиі қолданылатын, ФКС-ке екі негізгі корреляцияланбаған балама бар.

Фотоағартудан кейінгі флуоресценция қалпына келтіру (FRAP)

FRAP-те аймақ қысқа мерзімге қарқынды жарыққа ұшыратылып, флюорофорлардың қайта қалпына келмейтін фотоағартуына алып келеді, ал жақын орналасқан (ағартылмаған) флюорофорлардың диффузиясы нәтижесінде флуоресценцияның қалпына келуі бейнеленеді. FRAP-тің FCS-ке қарағанда басты артықшылығы – жасуша биологиясында кең таралған сапалық эксперименттерді түсіндірудің қарапайымдығы. Жасуша желілерінің, жасуша аймақтарының айырмашылықтары немесе дәрілік заттар қолдануға дейін және кейін, көбінесе фильмдерді қарапайым қарау арқылы сипатталады. FCS эксперименттеріне өңдеудің жоғары деңгейі қажет, сондай-ақ олар айналмалы диффузия, дірілдер, фотоағарту, жарықтандыру мен флуоресценция түсіне тәуелділік, жеткіліксіз статистика сияқты қате нәтижелерге әкелуі мүмкін факторларға сезімтал. FRAP-те өлшеу көлемін өзгерту әлдеқайда оңай, бұл жақсырақ бақылауға мүмкіндік береді. Іс жүзінде, көлемдер FCS-тегіден әдетте үлкен болады. FRAP эксперименттері көбінесе сапалық сипатта болғанымен, кейбір зерттеушілер FRAP-ті сандық тұрғыда зерттеп, байланыс динамикасын да қарастырады. FRAP-тің жасуша биологиясындағы кемшілігі – фотоағартудың салдарынан жасушаға туындайтын еркін радикалдардың әсері. Сонымен қатар, FRAP универсалды емес, себебі ол концентрацияны, айналмалы диффузияны немесе ко-локализацияны өлшеуге қабілетсіз. FRAP үшін FCS-ке қарағанда әлдеқайда жоғары концентрацияда флюорофорлар қажет.

Бөлшектерді бақылау

Бөлшектерді қадағалауда бөлшектер жиынтығының траекториялары өлшенеді, әдетте фильмдерге бөлшектерді қадағалау алгоритмдерін қолдану арқылы. Бөлшектерді қадағалаудың артықшылығы – барлық динамикалық ақпарат өлшеуде сақталады, FCS-тен айырмашылығы, онда корреляция динамиканы бір тегіс қисыққа дейін орташалайды. Бұл артықшылық күрделі диффузияны көрсететін жүйелерде айқын байқалады, онда орташа квадратты орын ауыстыруды тікелей есептеу, қалыпты немесе қуат заңы бойынша диффузиямен салыстыруға мүмкіндік береді. Бөлшектерді қадағалау үшін бөлшектерді ажырату қажет, сондықтан олар FCS үшін қажетті концентрациядан төмен болуы керек. Сонымен қатар, бөлшектерді қадағалау шуға сезімтал, бұл кейде нәтижелерге күтпеген әсер ете алады.

Автофлюоресценттік корреляциялық спектроскопия

Жақында ультракүлгін нанофотоника саласындағы жаңа жетістіктер, белгіленбеген (маркерленбеген) протеиндерді терең ультракүлгін сәулелендіру арқылы оларды қозу және динамикалық процестерді зерттеу мүмкіндігін берді, соның нәтижесінде жеке молекулаларды зерттеу дамыды.

Екі және үш фотоны бар FCS қозу

Екі фотонды немесе үш фотонды қозу арқылы алынатын FCS, органикалық және/немесе биологиялық үлгілерде кеңістіктік ажыратымдылықты арттырумен қатар, фотозиян мен фотокөңілділікті азайтуда бірнеше артықшылықтар береді.