Введение

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) – это статистический анализ стационарных флуктуаций интенсивности флуоресценции посредством временной корреляции. Теоретическая основа этого метода восходит к регрессионной гипотезе Л. Онсагера. Анализ позволяет определить кинетические параметры физических процессов, лежащих в основе наблюдаемых флуктуаций. Одно из интересных применений – анализ флуктуаций концентрации флуоресцентных частиц (молекул) в растворе. В этом случае регистрируется флуоресценция, излучаемая из очень малого объема раствора, содержащего небольшое количество флуоресцентных частиц (молекул). Интенсивность флуоресценции колеблется из-за броуновского движения частиц, то есть количество частиц в подпространстве, определяемом оптической системой, случайным образом изменяется вокруг среднего значения. Анализ позволяет определить среднее число флуоресцентных частиц и среднее время диффузии, необходимое частице для прохождения через данный объем. В конечном итоге, определяются как концентрация, так и размер частицы (молекулы). Оба параметра имеют важное значение в биохимических исследованиях, биофизике и химии. FCS – высокочувствительный аналитический метод, поскольку он позволяет наблюдать небольшое количество молекул (в наномолярных и пикомолярных концентрациях) в малом объеме (~1 мкм³). В отличие от других методов (например, HPLC-анализа), FCS не предполагает физического разделения компонентов; пространственное разрешение достигается за счет оптики. Кроме того, FCS позволяет наблюдать флуоресцентно-меченые молекулы в биохимических путях в неповрежденных живых клетках, открывая новую область – "биохимию in situ или in vivo", то есть отслеживание биохимических путей в целых клетках и органах. Обычно FCS используется в сочетании с оптической микроскопией, в частности, с конфокальной или двухфотонной микроскопией. В этих методах свет фокусируется на образце, а измеряемые флуктуации интенсивности флуоресценции (вызванные диффузией, физическими или химическими реакциями, агрегацией и т. д.) анализируются с помощью временной автокорреляции. Поскольку измеряемое свойство напрямую связано с величиной и/или количеством флуктуаций, существует оптимальный режим измерения, соответствующий моменту входа или выхода отдельных частиц из объема наблюдения (или их "включения" и "выключения" в объеме). Если одновременно измеряется слишком большое количество частиц, общие флуктуации становятся малыми по сравнению с общим сигналом и могут быть неразрешимыми. И наоборот, если отдельные флуктуационные события слишком редки во времени, одно измерение может занять недопустимо много времени. FCS является флуоресцентным аналогом динамического рассеяния света, который использует когерентное рассеяние света вместо (некогерентной) флуоресценции. При наличии подходящей модели FCS можно использовать для получения количественной информации, такой как коэффициенты диффузии, гидродинамические радиусы, средние концентрации, кинетические константы химических реакций и динамика синглет-триплетных переходов. Поскольку флуоресцентные метки доступны в различных цветах и могут быть специфически связаны с определенными молекулами (например, белками, полимерами, металлокомплексами и т. д.), можно изучать поведение отдельных молекул (в быстрой последовательности в сложных растворах). С развитием высокочувствительных детекторов, таких как лавинные фотодиоды, стало возможным регистрировать флуоресцентный сигнал от отдельных молекул в сильно разбавленных образцах. Это открыло возможность проведения экспериментов FCS в самых разных областях, от материаловедения до биологии. Появление генетически модифицированных клеток с белками, помеченными флуоресцентными белками (например, зеленым флуоресцентным белком), сделало FCS распространенным инструментом для изучения молекулярной динамики в живых клетках.

История

Техники корреляции сигналов впервые экспериментально применены к флуоресценции в 1972 году Магде, Элсон и Уэбб, поэтому их обычно считают "изобретателями" FCS. Эта техника была далее развита в ряде работ этими и другими авторами вскоре после этого, заложив теоретические основы и определив области применения. Около 1990 года, с появлением возможности детектировать достаточно малое количество флуоресцентных частиц, возникли две проблемы: не-гауссово распределение интенсивности флуоресценции и трехмерный конфокальный объем измерения в системе лазерной микроскопии. Первая проблема привела к анализу распределений и моментов флуоресцентных сигналов для получения молекулярной информации, что в итоге сформировало набор методов, известных как анализ яркости. Подробнее см. в обзоре Томпсона (1991). Начиная с 1993 года, ряд усовершенствований в методах измерения – в частности, использование конфокальной микроскопии, а затем двухфотонной микроскопии – позволили точнее определить объем измерения и подавить фоновый сигнал, что значительно улучшило отношение сигнал/шум и обеспечило чувствительность к отдельным молекулам. С тех пор интерес к FCS возродился, и по состоянию на август 2007 года в Web of Science было обнаружено более 3000 публикаций, использующих FCS. См. обзор Кричевского и Бонне. Кроме того, наблюдался всплеск активности, направленной на расширение возможностей FCS различными способами, например, для лазерного сканирования и конфокальной микроскопии с вращающимся диском (в отличие от стационарного одноточечного измерения), для использования перекрестной корреляции (FCCS) между двумя флуоресцентными каналами вместо автокорреляции, и для использования передачи энергии резонансного типа Förster (FRET) вместо флуоресценции.

Типичная установка

Типичная установка FCS состоит из лазерной линии (длина волны обычно варьируется от 405 до 633 нм (cw) и от 690 до 1100 нм (импульсный)), которая отражается в объектив микроскопа дихроическим зеркалом. Лазерный луч фокусируется в образце, содержащем флуоресцентные частицы (молекулы) в такой высокой степени разбавления, что лишь несколько частиц находятся в фокальном объеме (обычно от 1 до 100 молекул в одном фЛ). Когда частицы пересекают фокальный объем, они флуоресцируют. Этот свет собирается тем же объективом и, поскольку он сдвинут в красную область спектра относительно возбуждающего света, проходит через дихроическое зеркало, достигая детектора – обычно фотоэлектронного умножителя, лавинного фотодиода или сверхпроводящего нанопроволочного детектора одиночных фотонов. Полученный электронный сигнал может быть сохранен непосредственно в виде графика зависимости интенсивности от времени для последующего анализа или вычислен для непосредственного получения функции автокорреляции (что требует специальных карт захвата данных). Сама по себе кривая FCS представляет собой лишь временной спектр. Выводы о физических явлениях необходимо извлекать из нее с использованием соответствующих моделей. Параметры, представляющие интерес, определяются путем подгонки кривой автокорреляции к теоретическим функциональным зависимостям.

Объем измерения

Объем измерения представляет собой свертку геометрии освещения (возбуждения) и детектирования, обусловленную используемыми оптическими элементами. Полученный объем математически описывается функцией точечного рассеяния (или PSF), которая по сути является изображением точечного источника. PSF часто описывается как эллипсоид (с размытыми границами) с диаметром фокусировки в несколько сотен нанометров и почти один микрометр вдоль оптической оси. Форма существенно меняется (и оказывает значительное влияние на получаемые кривые FCS) в зависимости от качества оптических элементов (крайне важно избегать астигматизма и проверять реальную форму PSF на приборе). В случае конфокальной микроскопии и при использовании небольших апертур (около одной единицы Эйри), PSF хорошо аппроксимируется гауссианами:

где – пиковая интенсивность, r и z – радиальная и осевая координаты, а и – радиальный и осевой радиусы, и. Эта гауссианская форма используется при выводе функциональной формы автокорреляции. Обычно составляет 200–300 нм, а в 2–6 раз больше. Один из распространенных способов калибровки параметров объема измерения – проведение FCS на образце с известным коэффициентом диффузии и концентрацией (см. ниже). Коэффициенты диффузии для распространенных флуорофоров в воде приведены в последующем разделе. Гауссианская аппроксимация работает с разной степенью точности в зависимости от оптических деталей, и иногда могут быть применены поправки для компенсации ошибок, возникающих при аппроксимации.

Интерпретация функции автокорреляции

Для извлечения интересующих количественных характеристик данные автокорреляции можно аппроксимировать, как правило, используя алгоритм нелинейного метода наименьших квадратов. Функциональная форма аппроксимации зависит от типа динамики (и конкретной оптической геометрии).

Коррекция состояния триплета

Вышеуказанные автокорреляции предполагают, что флуктуации не обусловлены изменениями флуоресцентных свойств частиц. Однако для большинства (био)органических флюорофоров – например, зеленого флуоресцентного белка, родамина, красителей Cy3 и Alexa Fluor – некоторая доля освещенных частиц возбуждается в триплетное состояние (или другие нерадиационные состояния затухания) и затем не излучает фотоны в течение характерного времени релаксации. Обычно это время составляет порядка микросекунд, что, как правило, меньше, чем интересующая динамика (например, ), но достаточно велико для измерения. Для учета триплетного состояния к автокорреляции добавляется мультипликативный член. Для нормальной диффузии:

где – доля частиц, перешедших в триплетное состояние, а – соответствующее время релаксации триплетного состояния. Если интересующая динамика значительно медленнее релаксации триплетного состояния, коротковременную составляющую автокорреляции можно просто отбросить, и член, учитывающий триплетное состояние, будет избыточен.

Флуоресцентная перекрестная корреляционная спектроскопия (FCCS)

Иногда FCS используется для изучения молекулярных взаимодействий, основываясь на различиях во времени диффузии (например, продукт реакции ассоциации будет больше и, следовательно, иметь большее время диффузии, чем отдельные реагенты). Однако FCS относительно нечувствителен к молекулярной массе, что видно из следующего уравнения, связывающего молекулярную массу со временем диффузии глобулярных частиц (например, белков):

где – вязкость образца, а – молекулярная масса флуоресцентного вида. На практике время диффузии должно существенно различаться – как минимум в 1,6 раза, что означает, что молекулярные массы должны отличаться как минимум в 4 раза. Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) измеряет взаимодействия путем перекрестной корреляции двух или более флуоресцентных каналов (по одному каналу для каждого реагента), что позволяет более чувствительно выявлять взаимодействия, чем FCS, особенно когда изменение массы в реакции невелико.

Методы анализа яркости

Этот набор методов включает в себя число и яркость (N&B), гистограмму счета фотонов (PCH), анализ распределения интенсивности флуоресценции (FIDA), кумулянтный анализ и анализ распределения пространственной интенсивности. Также сообщается о комбинации нескольких методов. Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия преодолевает слабую зависимость скорости диффузии от молекулярной массы, анализируя совпадения по нескольким цветам. А как насчет взаимодействий между одинаковыми молекулами? Решение заключается в анализе яркости. Эти методы используют неоднородность в распределении интенсивности флуоресценции для измерения молекулярной яркости различных видов в образце. Поскольку димеры содержат в два раза больше флуоресцентных меток, чем мономеры, их молекулярная яркость будет примерно в два раза выше, чем у мономеров. Следовательно, относительная яркость является чувствительным показателем олигомеризации. Средняя молекулярная яркость связана с дисперсией и средней интенсивностью следующим образом:

Здесь и – соответственно, фракционная интенсивность и молекулярная яркость вида .

ФРЭТ-ФКС

Другой подход, основанный на FCS, к изучению молекулярных взаимодействий использует флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) вместо флуоресценции и называется FRET FCS. Как и в случае FCCS, при FRET используются два типа зондов, однако детектируется свет только тогда, когда эти зонды находятся очень близко друг к другу – настолько близко, чтобы обеспечить взаимодействие. Сигнал FRET слабее, чем флуоресцентный, но его преимущество заключается в том, что сигнал возникает только во время реакции (за исключением автофлуоресценции).

Сканирование FCS

При сканирующей флуоресцентной корреляционной спектроскопии (sFCS) объем измерения перемещается по образцу заданным образом. Использование сканирования обусловлено его способностью смягчить или устранить ряд проблем, часто возникающих в стандартной ФКС, и тем самым расширить область применения методов корреляции флуоресценции в биологических системах. Некоторые варианты ФКС применимы только к серийным сканирующим лазерным микроскопам. Спектроскопия корреляции изображений и ее модификации были реализованы на сканирующем конфокальном или сканирующем двухфотонном микроскопе, но также могут быть применены и к другим микроскопам, например, к конфокальному микроскопу с вращающимся диском. Растровый ICS (RICS) и FCS с позиционной чувствительностью (PSFCS) включают в анализ временную задержку между различными частями сканирования изображения. Кроме того, сканирования пониженной размерности (например, круговое кольцо), возможные только в сканирующей системе, позволяют исследовать временные масштабы между измерениями в одной точке и полным изображением. Траектория сканирования также может быть адаптирована для слежения за частицами.

Вращающийся диск FCS и пространственное отображение

Любой из методов корреляционной спектроскопии изображений также может быть выполнен на конфокальном микроскопе с вращающимся диском, который на практике позволяет достичь более высокой скорости получения изображений по сравнению с лазерно-сканирующим конфокальным микроскопом. Недавно этот подход был применен для изучения диффузии в пространственно-изменяющейся сложной среде, что позволило получить карту коэффициента диффузии с разрешением в пикселях. Пространственное картирование диффузии с использованием FCS впоследствии было расширено на систему TIRF. Пространственное картирование динамики с использованием корреляционных методов применялось и ранее, но только в отдельных точках или с низким разрешением. Затем измерения можно усреднить. Другой вариант ICS выполняет пространственную автокорреляцию изображений, предоставляя информацию о концентрации частиц. Затем корреляция усредняется по времени. Хотя белый шум камеры не автокоррелирует во времени, он автокоррелирует в пространстве – это создает амплитуду белого шума в пространственной функции автокорреляции, которую необходимо учитывать при подгонке амплитуды автокорреляции для определения концентрации флуоресцентных молекул. Естественным развитием версий временной и пространственной корреляции является пространственно-временная ИКС (STICS). В STICS отсутствует явное усреднение в пространстве или времени (присутствует только усреднение, свойственное корреляции). В системах с неизотропным движением (например, направленный поток, асимметричная диффузия) STICS позволяет извлекать информацию о направлении. Вариация, тесно связанная с STICS (через преобразование Фурье), – это k-пространственная корреляционная спектроскопия изображений (kICS). Существуют также варианты перекрестной корреляции ICS, которые позволяют определить концентрацию, распределение и динамику ко-локализованных флуоресцентных молекул. PICS – это мощный инструмент анализа, разрешающий корреляции на нанометровых длинах и миллисекундных временных масштабах. Адаптировано из методов пространственно-временной корреляционной спектроскопии изображений.

FCS сверхвысокого разрешения оптического флуктуационного изображения (fcsSOFI)

Оптическая флуктуационная визуализация сверхразрешения (SOFI) – это метод сверхразрешения, достигающий пространственного разрешения ниже дифракционного предела посредством постобработки анализа с использованием уравнений корреляции, аналогичных тем, что применяются в FCS. В то время как в первых публикациях о SOFI использовались флуктуации от неподвижных, мигающих флюорофоров, FCS был объединен с SOFI, где флуктуации создаются диффундирующими зондами, что позволяет получать сверхразрешающие пространственные карты коэффициентов диффузии. Это применяется для изучения диффузии и пространственных характеристик пористых и замкнутых материалов, включая жидкие кристаллы агарозы.

Общее внутреннее отражение FCS

Флуоресценция с полным внутренним отражением (TIRF) — это микроскопический метод, чувствительный только к тонкому слою вблизи поверхности покровного стекла, что значительно снижает фоновую флуоресценцию. Метод FCS был адаптирован для использования с этим типом микроскопа и называется TIR FCS. Поскольку интенсивность флуоресценции в TIRF экспоненциально уменьшается с расстоянием от покровного стекла (в отличие от гауссова распределения в конфокальной микроскопии), функция автокорреляции имеет иное строение.

Изображение FCS с использованием светопластиковой флуоресцентной микроскопии

Световая листовая флуоресцентная микроскопия или селективная плоскостная визуализационная микроскопия (SPIM) использует освещение, осуществляемое перпендикулярно направлению наблюдения, посредством тонкого листа (лазерного) света. При определенных условиях этот принцип освещения можно комбинировать с флуоресцентной корреляционной спектроскопией для получения пространственно-разрешенного изображения подвижности и взаимодействий флуоресцирующих частиц, таких как белки, меченные GFP, внутри живых биологических образцов.

Другие флуоресцентные динамические подходы

Существуют две основные альтернативы корреляционной спектроскопии флуоресценции (FCS), широко используемые для изучения динамики флуоресцентных частиц.

Восстановление флуоресценции после фотобеливания (FRAP)

В FRAP область кратковременно подвергается воздействию интенсивного света, необратимо фотообесцвечивающего флюорофоры, и визуализируется восстановление флуоресценции за счет диффузии близлежащих (необесцвеченных) флюорофоров. Основное преимущество FRAP перед FCS заключается в простоте интерпретации качественных экспериментов, часто используемых в клеточной биологии. Различия между клеточными линиями, областями клетки или до и после применения препарата часто можно охарактеризовать простым просмотром видеозаписей. Эксперименты FCS требуют определенной степени обработки и более чувствительны к потенциально вводящим в заблуждение факторам, таким как: ротационная диффузия, вибрации, фотообесцвечивание, зависимость от освещения и цвета флуоресценции, недостаточная статистика и т.д. Гораздо проще изменить объем измерения в FRAP, что обеспечивает больший контроль. На практике объемы обычно больше, чем в FCS. Хотя эксперименты FRAP обычно носят более качественный характер, некоторые исследователи изучают FRAP количественно, включая динамику связывания. Недостатком FRAP в клеточной биологии является нарушение клетки свободными радикалами, вызванное фотообесцвечиванием. Он также менее универсален, поскольку не позволяет измерять концентрацию, ротационную диффузию или ко-локализацию. FRAP требует значительно более высокой концентрации флюорофоров, чем FCS.

Отслеживание частиц

При отслеживании частиц измеряются траектории набора частиц, как правило, путем применения алгоритмов отслеживания частиц к видеозаписям. Отслеживание частиц имеет то преимущество, что вся динамическая информация сохраняется в измерениях, в отличие от FCS, где корреляционный анализ усредняет динамику до единственной гладкой кривой. Это преимущество особенно заметно в системах, демонстрирующих сложную диффузию, где непосредственное вычисление среднеквадратичного смещения позволяет легко сравнивать его с нормальной или степенной диффузией. Для применения отслеживания частиц частицы должны быть различимы, а значит, находиться в более низкой концентрации, чем требуется для FCS. Однако отслеживание частиц более чувствительно к шуму, который иногда может непредсказуемо повлиять на результаты.

Автофлуоресцентная корреляционная спектроскопия

Недавние достижения в ультрафиолетовой нанофотонике позволили разработать методы исследования отдельных молекул белков без использования меток, возбуждая их глубоким ультрафиолетовым излучением и изучая динамические процессы.

Двух- и трехфотонное возбуждение FCS

Двухфотонное или трехфотонное возбуждение в FCS позволяет добиться ряда преимуществ как в пространственном разрешении, так и в минимизации фотоповреждения/фотовыцветания органических и/или биологических образцов.