Кіріспе
Фермент белсенділігін өлшеудің зертханалық әдісі
Ферменттік талдаулар – фермент белсенділігін өлшеуге арналған зертханалық әдістер. Олар фермент кинетикасын және ферменттерді тежеуді зерттеу үшін маңызды.
Ферменттер бірліктері
Ферменттің саны немесе концентрациясы, кез келген басқа химиялық зат сияқты, молярлық өлшемдермен немесе фермент бірліктеріндегі активтілік арқылы көрсетілуі мүмкін.
Ерекше қызмет
Энзимнің ерекше белсенділігі – тағы бір жиі қолданылатын өлшем бірлігі. Бұл – ферменттің жалпы ақуыздың миллиграмына шаққандағы белсенділігі (мкмоль мин⁻¹ мг⁻¹ түрінде көрсетіледі). Ерекше белсенділік қоспадағы ферменттің тазалығын бағалауға мүмкіндік береді. Бұл ферменттің белгілі бір уақыт ішінде (минуттарда), белгілі жағдайларда, жалпы ақуыздың миллиграмына қатысты түзілген микромольдік өнім мөлшері. Ерекше белсенділік – реакция жылдамдығының реакция көлеміне және жалпы ақуыз массасына бөлінген шаманың көбейтілгеніне тең. СИ жүйесіндегі өлшем бірлігі – каталь/кг, бірақ практикалық тұрғыдан мкмоль/мгмин өлшем бірлігі тиімдірек. Ерекше белсенділік – ферменттің процессивностығын (ферменттің өңделу қабілетін) белгілі бір (әдетте қанықтыратын) субстрат концентрациясында өлшеуге арналған көрсеткіш және әдетте таза фермент үшін тұрақты болады. Өсіру партиялары арасындағы айырмашылықтардан және/немесе дұрыс бүктелмеген ферменттерден туындайтын қателерді жою үшін белсенді ортақты титрлеу процесін жүргізуге болады. Бұл – кері қайтарылмайтын ингибиторды қолдану арқылы белсенді ортақтардың мөлшерін титрлеу арқылы есептелген белсенді фермент мөлшерін өлшеуге арналған көрсеткіш. Сонда ерекше белсенділік μмоль мин⁻¹ мг⁻¹ белсенді фермент ретінде көрсетілуі керек. Егер ферменттің молекулалық салмағы белгілі болса, айналым саны, яғни белсенді ферменттің әр μмольіне секундына түзілетін μмоль өнім, ерекше белсенділіктен есептелуі мүмкін. Айналым саны – әр фермент молекуласының катализдік циклін секундына қанша рет орындайтынын көрсетеді.
Терминдер
Реакция жылдамдығы – бірлік уақыт ішінде (моль L-1 s-1) жоғалатын субстраттың (немесе түзілген өнімнің) концентрациясы. Тазалығын (%) 100% × (фермент үлгісінің нақты белсенділігі / таза ферменттің нақты белсенділігі) арқылы есептеуге болады. Лас үлгінің нақты белсенділігі төмендеу болады, себебі массаның бір бөлігі фермент емес. Егер 100% таза ферменттің нақты белсенділігі белгілі болса, лас үлгінің нақты белсенділігі төмен болады, бұл тазалықты есептеуге және осылайша дұрыс нәтиже алуға мүмкіндік береді.
Сынау түрлері
Барлық ферменттік талдаулар субстраттың тұтынуын немесе өнімнің уақыт өте келе өндірілуін өлшеуге арналған. Субстраттар мен өнімдердің концентрациясын өлшеудің көптеген әдістері бар, және көптеген ферменттерді бірнеше түрлі тәсілдермен талдауға болады. Биохимиктер фермент катализдейтін реакцияларды әдетте төрт түрдегі тәжірибелер арқылы зерттейді:
Бастапқы жылдамдық тәжірибелері. Фермент субстраттың көп мөлшерімен араластырылғанда, фермент-субстрат аралық қосылысы тез бастапқы транзиенттік кезеңде жинақталады. Содан кейін реакция тұрақты күйдегі кинетикаға жетеді, онда фермент-субстрат аралықтары уақыт өте келе шамамен тұрақты болып қалады және реакция жылдамдығы салыстырмалы түрде баяу өзгереді. Жылдамдықтар, квази-тұрақты күйге қол жеткеннен кейін қысқа мерзім ішінде өлшенеді, әдетте уақыт өте келе өнімнің жинақталуын бақылау арқылы. Өлшемдер өте қысқа мерзімде жүргізілетіндіктен және субстраттың көп мөлшерде болуына байланысты, еркін субстрат мөлшері бастапқы субстрат мөлшеріне шамамен тең деген шамалау жасауға болады. Бастапқы жылдамдық тәжірибесін орындау және талдау оңай, себебі ол кері реакция және ферменттердің ыдырауы сияқты асқынулардан салыстырмалы түрде босатылған. Сондықтан, бұл фермент кинетикасында ең көп қолданылатын тәжірибе түрі болып табылады. Прогресс қисығы тәжірибелері. Бұл тәжірибелерде кинетикалық параметрлер түрлердің концентрациясы уақыт функциясы ретінде анықталады. Субстрат немесе өнімнің концентрациясы бастапқы жылдам транзиенттен кейін және реакцияның тепе-теңдікке жетуіне жеткілікті уақыт беру үшін тіркеледі. Прогресс қисығы тәжірибелері фермент кинетикасының алғашқы кезеңінде кеңінен қолданылған, бірақ қазір аз таралған. Транзиенттік кинетика тәжірибелері. Бұл тәжірибелерде реакция мінез-құлқы бастапқы жылдам транзиент кезеңінде, аралық қосылыс тұрақты күйдегі кинетика кезеңіне жеткенде бақыланады. Бұл тәжірибелерді орындау жоғарыда аталған екі класс тәжірибелерге қарағанда қиынырақ, себебі оларға арнайы техникалар (мысалы, қамалған қосылыстардың фотолизі) немесе жылдам араластыру (мысалы, тоқтатылған ағыс, сөндірілген ағыс немесе үздіксіз ағыс) қажет. Тынығу тәжірибелері. Бұл тәжірибелерде фермент, субстрат және өнімнің тепе-теңдік қоспасы, мысалы, температураның, қысымның немесе pH-тың өзгеруімен бұзылады, және тепе-теңдікке оралу бақыланады. Бұл тәжірибелерді талдау толық қайтымды реакцияны қарастыруды талап етеді. Сонымен қатар, тынығу тәжірибелері механизмнің егжей-тегжейлі аспектілеріне өте сезімтал емес, сондықтан олар әдетте механизмді анықтау үшін қолданылмайды, бірақ тиісті жағдайларда қолданылуы мүмкін. Ферменттік талдауларды олардың сынама алу әдісіне сәйкес екі топқа бөлуге болады: үздіксіз талдаулар, онда талдау белсенділіктің үздіксіз оқуын береді, және үзілісті талдаулар, онда сынамалар алынады, реакция тоқтатылады, содан кейін субстраттар/өнімдердің концентрациясы анықталады.
Тұрақты талдаулар
Тұрақты талдаулар ең ыңғайлы, бір талдау реакция жылдамдығын көрсетеді, қосымша жұмыс қажет емес. Тұрақты талдаулардың көптеген түрлері бар.
Флюорометриялық
Флуоресценция — молекула басқа толқын ұзындығындағы жарықты сіңіргеннен кейін әртүрлі толқын ұзындығында жарық шығару құбылысы. Флюорометриялық талдаулар ферменттік реакцияны өлшеу үшін субстрат пен өнімнің флуоресценциясы арасындағы айырмашылықты пайдаланады. Бұл талдаулар, әдетте, спектрофотометриялық талдаулардан әлдеқайда сезімтал, бірақ қоспалардың болуынан және көптеген флуоресцентті қосылыстардың жарыққа ұшырағандағы тұрақсыздығынан туындаған бөгеттерге ұшырауы мүмкін. Мұндай талдаулардың мысалы – нуклеотидтік коферменттер NADH және NADPH-ті пайдалану. Бұл жағдайда, тотыққан формалар флуоресцентті, ал тотығуға ұшыраған формалары флуоресцентті емес. Сондықтан, тотығу реакцияларын флуоресценцияның төмендеуі арқылы, ал тотығуға түсу реакцияларын флуоресценцияның артуы арқылы бақылауға болады. Ферменттік катализделген реакция кезінде флуоресцентті бояуды босататын синтетикалық субстраттар да қолжетімді, мысалы, β-галактозидазаны анықтау үшін 4-метилумбеллиферил β-D-галактозид немесе Candida rugosa липазасын анықтау үшін 4-метилумбеллиферил бутират.
Калориметриялық
Калориметрия – химиялық реакциялар кезінде бөлінетін немесе сіңірілетін жылуды өлшеу. Бұл әдістер өте кең таралған, себебі көптеген реакциялар жылудың өзгеруімен жүзеге асады, ал микрокалориметрді пайдаланғанда, көп мөлшерде фермент немесе субстрат қажет болмайды. Бұл әдістерді басқа жолмен өлшеуге келмейтін реакцияларды анықтау үшін де қолдануға болады.
Химилюминесцентті
Химилюминесценция – химиялық реакция нәтижесінде жарық шығару құбылысы. Кейбір ферменттік реакциялар жарық шығарады, және бұл жарықтың мөлшерін өнімнің түзілуін анықтау үшін өлшеуге болады. Мұндай талдаулар өте жоғары сезімталдыққа ие болуы мүмкін, себебі реакциядан шыққан жарықты фотопленкамен бірнеше күн немесе апталар бойы тіркеуге болады, бірақ оны дәл бағалау қиын, өйткені реакция кезінде шыққан жарықтың бәрі анықталмайды. Ферментативтік химилюминесценция (ЭКЛ) арқылы аттың қызылша пероксидазасын анықтау – вестерн блоттегі антиденелерді анықтаудың кең таралған әдісі. Тағы бір мысал – люцифераза ферменті, ол шырылдақтарда кездеседі және өзінің люциферин субстратынан табиғи түрде жарық шығарады.
Жарық шашырау
Статикалық жарық шашырауы ерітіндідегі макромолекулалардың салмақ бойынша орташа молярлық массасы мен концентрациясының көбейтіндісін өлшейді. Егер өлшеу уақытында бір немесе бірнеше түрдің жалпы концентрациясы тұрақты болса, шашырау сигналы ерітіндінің салмақ бойынша орташа молярлық массасының тікелей көрсеткіші болып табылады, және ол кешендердің түзілуі немесе ыдырауы кезінде өзгереді. Осылайша, бұл өлшеу комплекстердің стехиометриясын және кинетикасын анықтайды. Ақуыз кинетикасын зерттеу үшін жарық шашырату әдісі – фермент қажет етпейтін, өте кең таралған техника.
Микромасштабты термофорез
Микромасштабты термофорез (МСТ) молекулалардың/субстраттардың мөлшерін, зарядын және гидратациялық энтропиясын тепе-теңдік күйінде өлшейді. Флуоресцентті таңбаланған субстраттың термофоретикалық қозғалысы фермент әсерінен өзгергенде айқын түрде өзгереді. Бұл ферменттік белсенділікті жоғары уақыт шешімімен нақты уақытта өлшеуге мүмкіндік береді. Толық оптикалық МСТ әдісінде материалдық шығын өте төмен, белсенділік және тежеу үшін ферменттік жылдамдық тұрақтыларын өлшеу үшін бар болғаны 5 мкл үлгі көлемі және 10 нМ фермент концентрациясы қажет. МСТ талдаушыларға егер екі субстрат әртүрлі флуорофорлармен таңбаланған болса, екі түрлі субстраттың өзгеруін бір уақытта өлшеуге (мультиплекстеуге) мүмкіндік береді. Осылайша субстраттар арасындағы бәсекелестік тәжірибелерін жүргізуге болады.
Тұрақты емес сынақтар
Үзіліспен жүргізілетін талдаулар — бұл ферменттік реакциядан белгілі интервалдармен үлгілер алынып, осы үлгілерде түзілген өнімнің мөлшері немесе субстраттың жұтылуы өлшенетін әдіс.
Радиометриялық
Радиометриялық талдаулар субстраттарға радиоактивтіліктің енуін немесе субстраттардан оның шығуын өлшейді. Бұл талдауларда ең көп қолданылатын радиоактивті изотоптар – 14C, 32P, 35S және 125I. Радиоактивті изотоптар субстраттың бір атомын нақты белгілеуге мүмкіндік беретіндіктен, бұл талдаулар өте жоғары сезімталдыққа және нақтылыққа ие. Олар биохимияда жиі қолданылады және көбінесе жасушаларды жарып (лиздеу) шығарғанда түзілетін ферменттердің күрделі қоспаларынан (шикі экстракттер) белгілі бір реакцияны өлшеудің жалғыз жолы болып табылады. Радиоактивтілік осы процедураларда әдетте сцинтилляциялық санауышпен өлшенеді.
Хроматографиялық
Хроматографиялық талдаулар реакциялық қоспаны хроматография арқылы құрамдас бөліктерге бөліп, өнімнің түзілуін өлшейді. Бұл әдетте жоғары өнімді сұйық хроматографиясы (HPLC) арқылы жасалады, бірақ жұқа қабатты хроматографияның қарапайым әдісі де қолданылуы мүмкін. Бұл тәсілге көп мөлшерде материал қажет болғанымен, субстраттарды/өнімдерді радиоактивті немесе флуоресцентті белгімен белгілеу арқылы сезімталдығын арттыруға болады. Сондай-ақ, сынақ сезімталдығын жақсартылған хроматографиялық құралдарға (мысалы, ультра жоғары қысымды сұйық хроматографиясына) көшу арқылы арттыруға болады, олар HPLC құралдарына қарағанда бірнеше есе жоғары сорғы қысымында жұмыс істейді (Қараңыз: Жоғары өнімді сұйық хроматографиясы#Сорғы қысымы).
Сынауға әсер ететін факторлар
Бірнеше фактор сынақ нәтижесіне әсер етеді және жақында жасалған шолуда сынақтың жұмыс істеуін қамтамасыз ету үшін бақылау қажетті әртүрлі параметрлер жинақталған.
Тұз концентрациясы
Энзимдердің көпшілігі өте жоғары тұз концентрациясын қабылдамайды. Иондар ақуыздардың әлсіз иондық байланыстарына бөгет жасайды. Көптеген ферменттер 1500 мМ тұз концентрациясында белсенді болады. Көбінесе, галофильді балдырлар мен бактериялар сияқты ерекше жағдайлар кездеседі.
Температураның әсері
Барлық ферменттер организмге тән температуралық диапазон ішінде жұмыс істейді. Температураның көтерілуі, әдетте, реакция жылдамдығының артуына алып келеді. Бірақ бұл артудың шегі бар, себебі жоғары температура реакция жылдамдығын күрт төмендетеді. Бұл ферменттің активті ортасының үш өлшемді құрылымын тұрақтандыратын әлсіз иондық және сутекті байланыстардың бұзылуынан туындаған ақуыз құрылымының денатурациялануына (өзгеріске ұшырауына) байланысты. Адам ферменттері үшін "оптималды" температура көбінесе 35-40 °C аралығында болады. Адамның орташа дене температурасы 37 °C құрайды. Адам ферменттері 40 °C-тан жоғары температурада жылдам денатурациялана бастайды. Ыстық су бұлақтарында табылған термофильді археялардың ферменттері 100 °C-қа дейін тұрақты болады. Дегенмен, ферменттік реакцияның "оптималды" жылдамдығы туралы түсінік шатастырады, өйткені кез келген температурада байқалатын жылдамдық екі жылдамдықтың көбейтіндісінен тұрады: реакция жылдамдығы және денатурация жылдамдығы. Егер сіз бір секунд ішінде белсенділікті өлшейтін анализ қолдансаңыз, ол жоғары температурада жоғары белсенділік көрсетеді, ал егер сіз бір сағат ішінде өнімнің түзілуін өлшейтін анализ қолдансаңыз, ол осы температурада төмен белсенділік көрсетеді.
pH әсері
Көптеген ферменттер pH-қа сезімтал және олардың белсенділігінің белгілі бір шегі бар. Барлығының да оңтайлы pH деңгейі болады. pH ферменттің үш өлшемді құрылымын иондық және сутекті байланыстарды бұзу арқылы өзгертіп, ферменттік белсенділікті тоқтатуы мүмкін. Көптеген ферменттер 6 және 8 pH аралығында жұмыс істейді, алайда асқазандағы пепсин 2 pH-та, ал трипсин 8 pH-та тиімдірек жұмыс істейді.
Субстраттың қанықтығы
Субстраттың концентрациясын арттыру реакция жылдамдығын (ферменттік белсенділігін) арттырады. Дегенмен, ферменттің қанығуы реакция жылдамдығын шектейді. Фермент, барлық молекулаларының белсенді орындарының көп бөлігі уақыттың басым бөлігінде толып тұрғанда қаныққан болып есептеледі. Қанығу нүктесінде, қанша субстрат қосылса да реакция жылдамдамайды. Реакция жылдамдығының графигі бір деңгейге жетеді.
Қатысу деңгейі
Ерітіндідегі макромолекулалардың көп мөлшері макромолекулалық тығыздық деп аталатын әсер арқылы ферменттік реакциялардың жылдамдығы мен тепе-теңдік тұрақтыларын өзгертеді.